[發明專利]一個龍膽酸雙加氧酶及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201711069144.2
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN107794271B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 何健;李娜;姚利;丁德榮;陶青
• 申請（專利權）人: 南京農業大學;北京大北農生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;C12N1/21;C02F3/34;B09C1/10;C12R1/19;C02F101/36;C02F101/34
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發明屬于應用環境微生物和農業領域，公開了一個龍膽酸雙加氧酶及其編碼基因和應用。一種龍膽酸雙加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1，全長1053bp，編碼350個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。龍膽酸雙加氧酶基因是首個公開能降解麥草畏中間代謝產物3?氯龍膽酸的基因，它編碼的蛋白能將龍膽酸和3?氯龍膽酸開環降解。本發明提供的龍膽酸雙加氧酶能在30min內降解100mg/l的龍膽酸和3?氯龍膽酸。因此，龍膽酸雙加氧酶基因dsmD在構建降解麥草畏轉基因作物中應用潛能巨大，龍膽酸雙加氧酶蛋白DsmD在降解麥草畏以及苯環類物質中應用前景很好。

技術領域

本發明屬于環境微生物和農業領域，涉及一個龍膽酸雙加氧酶及其編碼基因和應用,具體涉及參與麥草畏微生物降解過程中的一個龍膽酸雙加氧酶及其編碼基因的應用。

背景技術

化學農藥是保障現代農業生產力的重要手段，合理使用農藥可以有效的防治作物病害，提高作物產量，但是一旦農藥使用不當會造成土壤、水體等環境藥害。除草劑的使用能有效減輕農業勞動強度，提高作物產量，但是隨著除草劑的大量使用，其殘留對土壤造成的危害越來越嚴重。微生物修復技術是一種原位生物修復技術，效果好，費用低，無二次污染，適合大面積面源污染修復，是土壤有機污染物修復技術的主流和發展方向。抗除草劑轉基因是解決除草劑藥害的有效途徑，而抗除草機的基因一般均來自微生物降解基因。

麥草畏(dicamba)屬安息香酸系除草劑，對一年生和多年生闊葉雜草有顯著防除效果。麥草畏用于苗后噴霧，藥劑能很快被雜草的葉、莖、根吸收，通過韌皮部向上、下傳導，多集中在分生組織及代謝活動旺盛的部位，阻礙植物激素的正常活動，從而使其死亡，能防除200多種雜草，廣泛應用于玉米、高粱和小麥等農田雜草防治，目前全球使用量達1.5萬噸。同時麥草畏因廣譜、高效、低毒和雜草抗性產生慢等優點，被認為是理想的抗除草劑轉基因靶標除草劑。麥草畏在土壤中穩定，一般能保持40天以上。麥草畏在環境中的降解的主力軍是微生物，目前已篩選到多種麥草畏的降解菌株，克隆到多個麥草畏降解基因，關于麥草畏的微生物降解目前基本上第一步都是脫甲基生成無除草活性的3,6-二氯水楊酸3,6-DCSA，克隆到的基因和研究的酶均為麥草畏脫甲基酶。美國孟山都公司利用來自細菌的麥草畏脫甲基酶基因(dmo)(專利US7105724B2)成功構建抗麥草畏和草甘膦復合性狀的轉基因大豆和抗麥草畏、草甘膦和草銨膦的棉花，已經進入商品化階段。可以預見，隨著抗麥草畏轉基因作物的商業化推廣，麥草畏的使用量會大幅度提高。但是，到目前為止，微生物降解麥草畏微生物降解的第一步脫甲基產物3,6-DCSA的代謝途徑及其分子機制還不清楚，這嚴重制約了對麥草畏的環境行為和生態安全方面的研究。因此有必要深入研究麥草畏的遷移、轉化和降解等環境行為及生態安全性。

獲得麥草畏脫微生物代謝過程中降解基因和酶在治理農藥殘留中主要具有以下作用，(一)通過現代微生物發酵技術將酶制劑實現土壤原位修復。(二)通過現代生物技術將降解基因導入作物構建相應的除草劑抗性轉基因作物，綜上所述，開展麥草畏降解過程中的降解基因、酶的研究具有非常重要的理論和實際應用價值。

發明內容

本發明的目的是針對現有麥草畏降解途徑的研究的缺乏，提供一個龍膽酸雙加氧酶基因，該基因參與麥草畏下游降解路徑，同時能降解龍膽酸，龍膽酸是苯環類物質降解的主要開環產物之一，龍膽酸雙加氧酶基因的應用具有重要的價值。

本發明的又一目的是提供該龍膽酸雙加氧酶基因編碼的蛋白DsmD的應用。

一種龍膽酸雙加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

所述的龍膽酸雙加氧酶基因dsmD編碼的雙加氧酶蛋白DsmD，其氨基酸序列為SEQID NO.2。

含有所述的龍膽酸雙加氧酶基因dsmD的重組表達載體。

所述的重組表達載體，優選是將所述的龍膽酸雙加氧酶基因dsmD插入pET-24b(+)的NdeI和XhoI位點之間所得。