[發明專利]一種參附高烏甲素誘導白血病細胞株HL-60的方法

在審

• 申請號: 201711069104.8
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN109745369A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 王永紅
• 申請（專利權）人: 王永紅
• 主分類號: A61K36/714
• 分類號: A61K36/714;A61P35/00;A61K31/439
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種參附高烏甲素誘導白血病細胞株HL?60的方法，用人類急性白血病細胞株HL?60為模型，參附注射液25.50μL/mL,高烏甲素100μL/mL，亞砷酸鈉15μmol/L；檢測細胞增殖、細胞形態、硝基四氮唑藍（NBT）還原能力、細胞周期分布、凋亡率等指標。經藥物處理60h后HL?60細胞均出現程度不同以凋亡為主的形態改變；低濃度參附注射液（12.5μL/mL）、高烏甲素注射液（50μL/mL）作用60h后HL?60細胞NBT還原能力增強，藥物處理60h后，100μL/mL高烏甲素液及25.50μL/mL參附液流式細胞儀檢測直方圖上呈現亞二倍體凋亡峰，凋亡率呈不同程度增高。

技術領域

本發明涉及一種參附高烏甲素誘導白血病細胞株HL-60的方法，具體地說是以一種參附高烏甲素誘導白血病細胞株HL-60的方法。

背景技術

目前公知的中醫藥抗腫瘤研究領域根據《內經》“積之始生，得寒乃生，厥乃成積”、“陽化氣，陰成形”的理論，逐步重視溫陽法的研究。

發明內容

材料與方法 1、主要藥物 參附注射液每毫升相當于生藥紅參0.1g,附片0.2g，由雅安三九藥業有限公司生產（批號：20043116）；氫溴酸高烏甲素注射液（2mg/mL，由廣州天心藥業股份有限公司生產 ，批號：040501）；亞砷酸氯化鈉注射液由哈爾濱伊達藥業有限公司生產（批號：20050302）。以上藥物均購自廣東省中醫院藥房，臨用時以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）稀釋。2、主要試劑；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）均由Sigma公司生產；Wright-Giemsa混合染液由廣州人仁公司提供；佛波酯（TPA）由Clbiochem公司生產；硝基四氮唑藍（NBT）由Mbchem公司生產；碘化丙啶（PI）染色液由Becton Dickinson公司生產。 3、主要儀器；Bio-Rad-450型全自動酶標儀為美國Bio-Rad公司產品；150-400型細胞培養箱為英國Biotech公司產品；3169型倒置顯微鏡為日本Nikon公司產品；SW-CJ-IF型超凈工作臺為蘇州凈化設備廠產品；TGL-16型高速冷凍離心機為德國Sigma公司產品；NexPower1000型純水器為韓國Human Corp產品； FACSCalibur型流式細胞儀為Becton Dickinson公司產品；普利生MIAS 2000型智能骨髓圖像分析系統為北京—深圳普利生公司產品；Nikon E200型普通光學顯微鏡為日本Nikon公司產品。4、細胞模型；HL-60細胞株購自中山大學動物中心細胞庫，在廣州中醫藥大學基礎醫學院生化教研室實驗室傳代培養。實驗時取對數生長期細胞， 2g/L臺盼藍拒染實驗證實活細胞數大于95%，并調整實驗時所需密度。5、實驗方法和檢測指標；分組；設參附注射液、氫溴酸高烏甲素注射液實驗組（簡稱參附液組、高烏甲素組），在實驗的不同階段，參附液組終濃度分別為12.5、25、50、100μL/mL，高烏甲素組終濃度分別為25、50、100μL/mL，亞砷酸鈉對照組則取0.25、2、15μmol/L 3個濃度。并設空白（本底）對照組、陰性對照組。細胞加藥培養；在實驗的不同階段，按相應的設計要求接種制備好的細胞懸液到12或96孔培養板中（每孔細胞量見具體項目），分別加培養基及藥物。96孔培養板中每孔加含體積分數為15%小牛血清的RPMI-1640培養基180μL，然后按不同濃度加藥，最后不足200μL的孔則用PBS補足至每孔總體積為200μL；12孔培養板中每孔加含體積分數為15%小牛血清的RPMI-1640培養基至終體積2.5mL,再按不同濃度加藥。然后分別置入37℃、體積分數為5%CO2飽和濕度條件下的細胞培養箱培養。每天將接種好的培養板取出置于倒置顯微鏡下觀察1～2次，以及時掌握細胞生長狀況。不同藥物及濃度對HL-60細胞生長的影響；參附液、高烏甲素各設3個不同的藥物濃度組，以細胞終濃度為2×104/mL接種到96孔培養板中，培養48h后采用MTT法檢測各組存活率、半數抑制濃度（IC50）。細胞增殖抑制的MTT測定：加藥培養后每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，在細胞培養箱孵育4h后取出，用1.5mL離心管離心去上清，每管加DMSO 150μL，按原順序放回96孔板輕輕震蕩15min,采用酶標儀在570nm波長下測定各孔D值，根據下列公式計算細胞存活率：p細胞存活=（D加藥組/D對照組）×100%。不同作用時間對HL-60細胞生長的影響；參考1.5.3的結果，取96孔板接種細胞。高烏甲素組設終濃度為50μL/mL，參附液組設終濃度為50μL/mL，細胞終濃度為2×104/mL，分別在培養24、48、72h取出相應培養板，按上法進行MTT檢測。計算各組存活率，繪制生長曲線。細胞形態觀察；進行1.5.3、1.5.4指標檢測時每天將接種好的培養板取出，置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況1～2次。12孔板中每孔接種2×105個細胞培養60h后用PBS漂洗2次后，以體積分數為70%的乙醇將細胞固定后收集固定細胞涂片，吹干， Wright-Giemsa混合染液及甲基綠—派諾寧染色，晾干后普通光學顯微鏡下，觀察200個細胞進行分類計數，智能骨髓圖像分析系統拍照記錄。NBT實驗（還原反應比色法）；以每孔3×103個細胞接種到96孔板中培養5d后，1 000r/min離心5min收集細胞，再將細胞懸浮于200μL /孔的NBT溶液中（內含0.24μg/mL的TPA），放入培養箱中培養1h，細胞離心去上清液，每孔加入200μLDMSO，室溫下震蕩20min，在570nm波長下測定D值。流式細胞儀檢測細胞周期分布、凋亡率；12孔板中每孔接種2×105個細胞培養60h，用PBS漂洗2次，調整細胞至1×106個/mL，再加體積分數為70%的乙醇（-20℃ ）固定細胞過夜后，上流式細胞儀以PI單染法檢測細胞周期分布、凋亡率。統計學處理 采用Microsoft Excel軟件進行統計分析。