[發明專利]一種萊克多巴胺特異性免疫親和層析色譜膠及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201711065894.2
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN108490082A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 吳康;喬春華;宋學宏;章雪明;方強
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N33/577
• 代理公司: 寧波高新區核心力專利代理事務所(普通合伙) 33273
• 代理人: 袁麗花

1.一種萊克多巴胺特異性免疫親和層析色譜膠，其特征在于，由保藏編號CCTCCNO.C2014127的雜交瘤細胞株分泌產生單抗經純化再與CNBr-activated Sepharose^TM 4B膠化學交聯形成固相化抗體蛋白而獲得。

2.根據權利要求1所述的免疫親和層析色譜膠，其特征在于，所述分泌產生的單抗經間接競爭ELISA測定：IC₅₀為0.35ppb，效價為1：800000，對萊克多巴胺的交叉反應率為100％，與其他β-激動劑的交叉反應率均小于0.005％。

3.根據權利要求1或2所述的免疫親和層析色譜膠，其特征在于，所述純化單抗蛋白與CNBr-activated Sepharose^TM 4B膠的用量比：5mg純化單抗蛋白：1ml CNBr-activatedSepharose^TM 4B溶脹膠。

4.一種根據權利要求1-3所述免疫親和層析色譜膠的制備方法，其特征在于，包括：

步驟1、用保藏編號CCTCC NO.C2014127的雜交瘤細胞株獲取單克隆抗體并進行純化，純化后的單抗蛋白進行透析預處理，備用；

將CNBr-activated Sepharose^TM 4B進行溶脹、淘洗獲得處理膠備用；

步驟2、預處理純化單抗蛋白中加入步驟1所述處理膠，室溫下擺動孵育，然后離心棄上清，加入NaHCO₃/NaCl緩沖溶液，室溫下繼續擺動孵育離心棄上清，洗滌，獲得抗體蛋白交聯膠；

步驟3、取步驟2中抗體蛋白交聯膠加入Tris-HCl置于室溫下擺動孵育以封閉交聯膠中未與單抗蛋白交聯的活化基團，離心棄上清，然后用HAC-NaAC/NaCl以及Tris-HCl/NaCl兩種緩沖液交替離心洗滌，再將交聯膠重懸于Tris-HCl/NaCl緩沖液并補加NaN₃，于0℃保存備用，即獲得所述免疫親和層析色譜膠。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述純化單抗蛋白的透析預處理為：純化單抗蛋白置于透析袋中，于NaHCO₃/NaCl緩沖溶液中4℃透析過夜，透析后單抗蛋白微孔濾膜過濾，濾液于4℃保存備用。

6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述將CNBr-activated Sepharose^TM4B進行溶脹、淘洗預處理為：稱取CNBr-activated Sepharose^TM 4B凍干粉加入稀HCl溶脹，離心棄上清，加入稀HCl離心洗滌以去除CNBr-activated Sepharose^TM 4B膠中其他小分子化學試劑后，再用NaHCO₃/NaCl緩沖溶液離心洗滌一次，備用。

7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2為：預處理的純化單抗蛋白中加入至含步驟1所述處理膠的50ml離心管中，蓋好并用parafilm膜封口，置于擺床中室溫擺動孵育1h，室溫2000r/min 10min棄上清，離心管加30ml 0.1M NaHCO₃/0.5M NaCl緩沖溶液，置于擺床中室溫擺動孵育10min，室溫2000r/min 10min棄上清，再用上述緩沖溶液重復離心洗滌5-6次以充分去除未交聯的蛋白，獲得抗體蛋白交聯膠。