[發明專利]一種誘導人多能性干細胞分化為脊髓運動神經前體細胞的方法

有效

• 申請號: 201711065890.4
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107858331B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 王娟;馬靜;辛文
• 申請（專利權）人: 北京全式金生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

1.一種誘導人多能性干細胞分化為脊髓運動神經前體細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)人多能性干細胞的培養：將人多能性干細胞消化成單細胞，接種至包被好的培養皿中進行貼壁培養，所用的培養液為多能性干細胞培養液，37℃5％CO₂飽和濕度培養箱培養20-28小時；

2)脊髓運動神經前體細胞的分化誘導：在基礎完全培養基中培養步驟1)獲得的人多能性干細胞，在不同時間添加不同的時空特異性信號通路調控小分子或生長因子誘導分化，每兩天換液一次，37℃5％CO₂飽和濕度培養箱培養8-20天，即可；

其中，所述基礎完全培養基由基礎培養基和營養添加劑組成；

所述營養添加劑組成成分和最終使用濃度分別為：人胰島素20mg/L、維生素C 200mg/L、谷胱甘肽100mg/L、亞麻酸5mg/L、肉毒堿20mg/L、N-乙酰半胱氨酸500μM、乙醇胺10mg/L、亞油酸5mg/L；

所述在不同時間添加不同的時空特異性信號通路調控小分子或生長因子具體為：TGFβ信號通路抑制劑為LDN193189 0.1μM和SB431542 10μM，作用時間為分化D2-D4；Wnt信號通路激活劑為CHIR99021 1μM和6-BIO 2μM，作用時間為分化D2-D6；SHH信號通路激活劑為purmorphamine 2μM，作用時間為分化D0-D16；視黃酸信號通路激活劑為視黃酸500nM，作用時間為分化D0-D16。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基礎培養基為DMEM/F12 medium、Neurobasal medium中的一種或兩種。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述基礎培養基為體積比為1:1的DMEM/F12 medium和Neurobasal medium混合培養基。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述多能性干細胞培養液為mTeSR和E8培養液。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述多能性干細胞培養液為E8培養液。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述多能性干細胞培養液中還加入了ROCK信號通路抑制劑。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述ROCK信號通路抑制劑為Y27632，最終使用濃度為10μM。