[發(fā)明專利]一種大黃魚的抗氧化反應(yīng)指示物在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201711064716.8 | 申請日： | 2017-11-02 |
| 公開（公告）號： | CN107604057A | 公開（公告）日： | 2018-01-19 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 曾霖;王永紅 | 申請（專利權(quán)）人： | 浙江海洋大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6876 | 分類號： | C12Q1/6876 |
| 代理公司： | 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙)33213 | 代理人： | 吳秉中 |
| 地址： | 316000 浙江省舟山市普陀海*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 大黃魚 氧化 反應(yīng) 指示 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及反應(yīng)指示物領(lǐng)域，尤其是涉及一種大黃魚的抗氧化反應(yīng)指示物。
技術(shù)背景
氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧ROS（reactive oxygen species）直接或間接地損傷細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，是眾多疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。機體形成了一套復雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)，當暴露于親電子試劑或活性氧刺激時，能誘導出一系列的保護性蛋白，以緩解細胞所受的損害。NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-related nuclear factor 2，Nrf2）在細胞抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch-like-ECH-associated protein 1，Keap1）大量結(jié)合并在細胞質(zhì)中快速降解。一旦細胞受到應(yīng)激，Nrf2與Keap1分離，進入細胞核中調(diào)控抗氧化酶相關(guān)基因的表達。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種大黃魚的抗氧化反應(yīng)指示物的用途，大黃魚的抗氧化反應(yīng)指示物有助于考察海水中的重金屬污染情況，具有較高的現(xiàn)實意義。
本發(fā)明的目的之二在于提供一種大黃魚的抗氧化反應(yīng)指示物的確定方法，本抗氧化反應(yīng)指示物的確定方法較為簡單，精確度較高。
本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：一種大黃魚的抗氧化反應(yīng)指示物，大黃魚中Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的表達與Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx1a、GPx1b和GR的基因表達水平存在正相關(guān)，Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的表達與Nrf2的蛋白含量也存在正相關(guān)，因此，Nrf2的mRNA豐度和蛋白含量可作為大黃魚抗氧化反應(yīng)的指示物，這有助于人們了解水中重金屬離子對魚的抗氧化反應(yīng)的分子機制，進而有助于通過大黃魚來考察海水中的重金屬污染物，因此具有較高的現(xiàn)實意義。
作為優(yōu)選，確定Nrf2的mRNA豐度和蛋白含量作為大黃魚抗氧化反應(yīng)指示物的方法包括：馴化大黃魚、提取肝臟物質(zhì)、RT-PCR實時熒光定量檢測，具體包括以下步驟：
馴化大黃魚：將大黃魚在圓形玻璃缸中圈養(yǎng)15-20天，每天2-3次投喂商業(yè)飼料，飼料中脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的干物含量分別為10-11%與48-50%，選取135條均一尺寸、重量為86-92g的大黃魚隨機分配到9個玻璃缸中，玻璃缸連續(xù)曝氣，每天換水，每天維持14-15小時光照、9-10小時黑暗，水質(zhì)參數(shù)如下：水溫20-28℃，鹽度25.5-26.5、溶氧量6.8-7.2mg/L，pH值為7.52-8.04，水質(zhì)硬度為碳酸鈣濃度120-125mg/L；將HgCl2加入到養(yǎng)殖水缸中配成含Hg溶液，Hg的含量分別為32、64μg Hg L-1，取暴露在含Hg溶液中的大黃魚浸泡在苯佐卡因中被麻醉過量致死，取肝臟樣本待用；經(jīng)測定，大黃魚在急性無機汞環(huán)境下暴露96小時的半數(shù)致死率（LC50）為160μg Hg L-1，在大黃魚的擬生長環(huán)境下進行檢測不僅可以精細化地測定抗氧化反應(yīng)指示物的特異性，而且基于人道主義考慮，同時保護了生態(tài)；
提取肝臟物質(zhì)：肝臟樣本被均質(zhì)到10-15倍的冰冷的緩沖液中，緩沖液組成為：1.0-1.2mMEDTA、1.0-1.2mMDTT、0.5-0.6M蔗糖溶液、0.15-0.18MKCl、0.13-0.15μM（S）-4-芐基-2-唑烷酮，pH為7.6-7.8；肝臟勻漿在0-4℃下以900-1000g離心8-10分鐘以沉淀大粒子，然后再次在0-4℃下以12000-14000g離心15-20分鐘，收集漂浮物并于-80~-100℃保存以供生化分析；通過肝臟組織可以對銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶1a（GPx1a）、谷胱甘肽過氧化物酶1b（GPx1b）和谷胱甘肽還原酶（GR）等抗氧化酶的酶活性進行定量檢測；緩沖液中的（S）-4-芐基-2-唑烷酮能夠與肝臟組織中的鉛離子、銅離子、汞離子等二價重金屬離子形成絡(luò)合物，將重金屬離子從組織中分離入溶液中，同時緩沖液還可以分離肝臟樣本中無用的脂肪、雜蛋白等雜質(zhì)，不會對肝臟組織中各抗氧化酶與總RNA造成分解與影響，提高檢測的精確度；
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