[發明專利]一種亞砷酸對人肺腺癌細胞體外抑制的方法

在審

• 申請號: 201711064531.7
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN109745339A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 王燕俠
• 申請（專利權）人: 王燕俠
• 主分類號: A61K33/36
• 分類號: A61K33/36;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種亞砷酸對人肺腺癌細胞體外抑制的方法，以體外培養的人肺腺癌細胞株（LAC）細胞為研究對象，選用對數生長期細胞，培養24h后，分別加入不同濃度的亞砷酸（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L)，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測LAC細胞的生長抑制率；酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測p53基因的表達變化情況。

技術領域

本發明涉及一種亞砷酸對人肺腺癌細胞體外抑制的方法，具體地說是以一種亞砷酸對人肺腺癌細胞體外抑制的方法。

背景技術

目前公知的中藥砒霜（三氧化二砷，AS２Ｏ３）及砷制劑對腫瘤的治療是近年來的研究熱點，特別是對白血病的治療已為人們所關注。砷作為抗腫瘤藥物在我國已有百年歷史，中藥傳統方劑青黃散、十味丸等治療不同類型的白血病確有一定療效，經鑒定其中有效成分為含砷中藥。近年來的實驗與臨床研究發現，三氧化二砷對肺癌有良好的抗腫瘤作用，其作用機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡、抑制其增殖、逆轉耐藥等有關，但其治療肺癌的確切機理未完全闡明。

發明內容

材料和方法

1、細胞株、藥物與試劑LAC細胞株由廣州軍區總醫院分子腫瘤學研究所細胞室提供；亞砷酸注射液，批號：19990191，由哈爾濱伊達藥業有限公司生產；胎牛血清（FSC）為中國醫學科學院血液學研究所產品；RPMI1640培養基、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）均為GIBCO公司產品；人p53定量酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自上海森雄科技實業有限公司。

2、細胞培養將凍存的LAC株按常規方法復蘇，接種于RPMI1640培養液（含體積分數為10％FSC、100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素）中，于37℃、體積分數為5%CO2濃度及飽和濕度的恒溫培養箱中培養，細胞呈單層貼壁生長，每2～３d傳代1次；傳代時用0.25g／Ｌ的胰蛋白酶和0.2g／ＬＥＤＴＡ消化2～３min，以培養液吹打制成細胞懸液，接種至50mL培養瓶，至細胞生長旺盛后，取對數生長期細胞用于實驗。

3、細胞形態觀察選用對數生長期細胞，用胰蛋白酶消化后，采用培養細胞計數法，用1640液稀釋成2×105/mL濃度的細胞懸液接種至50mL培養瓶；置于37℃、體積分數為5％CO2及飽和溫度的恒溫培養箱中培養24h后，實驗組分別加入各種濃度（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L）的亞砷酸，模型組則加入不含藥的細胞培養液。置于CO2培養箱中培養48h、72h后，將培養瓶置于倒置相差顯微鏡下進行細胞生長狀態的觀察。

4、MTT比色法檢測LAC腫瘤細胞的生長抑制率選用對數生長期細胞，用胰蛋白酶消化后，采用培養細胞計數法，用RPMI1640培養液稀釋配成1×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔接種100μL，在ＣＯ２培養箱中培養24h后，實驗組加入不同濃度的亞砷酸（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L）100μL，模型對照組則換含等體積溶劑的培養基，每組設16孔；每日更換新鮮培養液，以維持亞砷酸藥液濃度不變；在ＣＯ２培養箱中培養24、48、72h后每孔加入20μLMTT無血清培養基，37℃繼續培養4h后，每孔加入100μLDMSO，振蕩混勻后，在酶標儀上檢測492nm處各孔吸光度（Ｄ）值，計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率：p抑制／%＝（1－Ｄ實驗組／Ｄ模型組）×100％。人p53基因的檢測選用對數生長期細胞，用胰蛋白酶消化后，采用培養細胞計數法，用1640培養液稀釋成2×105/mL濃度的細胞懸液接種至50mL培養瓶中；在ＣＯ2培養箱中培養24h后，實驗組分別加入各種濃度（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L）的亞砷酸，模型對照組則加入不含藥的細胞培養液；置ＣＯ２培養箱中培養48h后收集細胞，過濾后離心，吸取細胞培養上清液用于實驗。按p53ELISA試劑盒操作要求，依次加樣、洗滌、孵育、洗滌，于酶標儀492nm波長處比色。測定樣品的吸光度值。統計學方法數據采用SPSS100軟件包處理。