[發明專利]稀有細胞單細胞水平的分離及檢測方法

有效

• 申請號: 201711063684.X
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107674861B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 閻灼輝;錢祺
• 申請（專利權）人: 蘇州浚惠生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/6886
• 代理公司: 上海和躍知識產權代理事務所(普通合伙) 31239
• 代理人: 杜林雪;尹洪波

一種對體液樣本中的稀有細胞進行單細胞水平的分離的方法，包含：將體液樣本以細胞懸液的形式均勻添加至復合濾膜上，細胞懸液包括作為多數細胞的白細胞和作為稀有細胞的病變細胞，其中復合濾膜包括陣列的1000片以上獨立的、可尋址的子濾膜，每片子濾膜中含有孔徑在3微米至10微米的微孔進行加壓過濾以使得50％以上的子濾膜各自截留的白細胞的數目不超過10個；對有核細胞用熒光標記的病變細胞標志物進行標記處理；對截留的有核細胞進行熒光成像從而確定截留了具有特定熒光特征的病變細胞的子濾膜在復合濾膜上的位置。本方法可以快速、簡便和高回收率地以單細胞水平分離稀有細胞。

技術領域

本發明屬于稀有細胞分離和檢測領域，具體涉及一種從人體體液中分離和檢測稀有細胞的方法。

背景技術

人外周血中的循環腫瘤細胞(CTC)是指由腫瘤病灶播散進入外周血循環的腫瘤細胞，并在一定條件下可發展為腫瘤轉移性病灶。CTC反映了腫瘤病灶的分子特征，并且是腫瘤血行轉移的直接來源，因此CTC檢測越來越引起重視。CTC在外周血中含量極少，每10ml血液可能僅含幾個到幾十個循環腫瘤細胞，卻有多達約1億個白細胞和500億個紅細胞，因此從外周血中快速、高效的分離循環腫瘤細胞是后續對循環腫瘤細胞計數、以及分子、功能分析的前提。同時，由于腫瘤細胞具有異質性，因此對于CTC的單細胞分析也極為重要。

目前CTC的檢測主要分兩步，第一步是CTC的富集分離，第二步是對富集后的CTC進行進一步的鑒定。

CTC的富集分離方法主要依賴于腫瘤細胞與血液細胞在物理、化學或生物學性質的不同，可分為兩類。一類是基于CTC與血液細胞物理性質上的差異，如細胞大小，腫瘤細胞一般來說比血液細胞更大、更不容易變形。針對這一物理性質的差異，典型的富集分離方法就是采用濾膜的方法富集CTC并進一步通過病理學染色或免疫染色來鑒定CTC。由于一定比例的白細胞同樣尺寸較大，這一方法往往會在富集后仍有較多的白細胞。更重要的是，由于CTC卡在濾膜上的微孔內，這一方法無法將富集到的CTC取出做進一步的分子分析，更無法進行單細胞的分離。另一類CTC富集分離方法主要基于CTC表面與血液細胞不同的獨特抗原，通過針對CTC表面獨特抗原的抗體或核酸適配體實現CTC的捕獲并與血液中其他細胞分離。但目前缺乏腫瘤細胞特異性抗原，因此在捕獲后還需進一步的免疫染色以鑒定CTC。可用于捕獲CTC的抗原包括上皮細胞抗原EpCAM，器官特異性標志物(如PSA、CEA和HER-2)，EMT標志物等。針對這些抗原的抗體常被修飾于磁球或微流控復合濾膜表面以捕獲血液中的CTC。通過微流控復合濾膜捕獲的CTC同樣存在難以釋放CTC以進行分子檢測的問題。通過磁球捕獲的CTC(如目前唯一獲得美國FDA批準的CellSearch系統)雖處于游離狀態，但即使在捕獲后仍然存在較多血液細胞的干擾，難以獲得純的CTC進行分子檢測，更難以將CTC分離成單細胞進行檢測。

對富集后的CTC進行進一步的鑒定。傳統的標記物(上皮細胞標記物等)鑒定血液中的CTC，在可靠性和獲得細胞的活性上被學者們質疑。基于“瓦博格效應”，與PET-CT原理類似，即由于腫瘤細胞內葡萄糖轉運蛋白的過度表達以及增強的己糖激酶、磷酸果糖激酶及丙酮酸脫氫酶活性，使腫瘤細胞的葡萄糖無氧代謝活動增強。所以可以通過檢測細胞攝取葡萄糖的水平來區別腫瘤細胞和正常體細胞。

由于CTC的分子檢測，尤其是單細胞分子檢測極為重要，因此目前CTC領域面臨的重大技術挑戰是無法獲得純的CTC群體進行分子分析，以及獲得單個CTC進行單細胞分子分析。解決這一問題的一個可行的思路是通過顯微操作設備將鑒定到的CTC一一取出，或置于不同的PCR管或384孔板內進行單細胞分子分析，或置于同一個PCR管內合并起來進行后續分子分析。但顯微操作設備的不足之處在于非自動化操作以及容易在操作、轉移單細胞過程中丟失細胞，其原因是分離細胞常采用毛細管，而毛細管容易黏住細胞無法成功轉移，或雖能轉移但無法準確轉移至PCR管底部導致后續分子反應難以進行。

因此，針對目前稀有細胞富集過程復雜、單細胞回收困難等情況，需要更高自動化的簡便、高效的稀有細胞單細胞水平的分離方法。

發明內容