[發明專利]瘤胃真菌木糖異構酶基因及其應用

有效

• 申請號: 201711063478.9
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107815461B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 王智;頓寶慶;李桂英;路明
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N9/92;C12N1/19;C12N15/81;C12P19/02;C12P7/06
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

本發明涉及一種新的來自瘤胃真菌的木糖異構酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明將包含該基因的重組質粒導入宿主細胞中，獲得了一種新的酵母工程菌。經實驗證實，將該基因在釀酒酵母中表達后，原來不具備轉化木糖為木酮糖的能力的釀酒酵母獲得了該轉化能力。該工程菌通過發酵含有木糖的培養基可以制備乙醇和其他發酵產物。

技術領域：

本發明涉及一種木糖異構酶基因，具體涉及來自瘤胃真菌的木糖異構酶基因及其轉化木糖為木酮糖的功能，本發明還涉及含該基因的重組質粒及工程菌株，以及用該工程菌通過發酵含有木糖的培養基制備乙醇和其他發酵產物的應用。

背景技術：

將木質素纖維素以產業化方式生產乙醇是既經濟又環保的方式。因為來自植物的木質纖維素原料是可以大量獲得的可再生資源。但是許多能夠發酵生產乙醇的酵母(如釀酒酵母)并不能以木糖作為碳源。因此，需要提供能夠利用木糖作為碳源進行乙醇發酵的酵母。

釀酒酵母具有木酮糖代謝的完整酶系，如果能夠將植物的木質纖維素中的木糖異構化，生成木酮糖，釀酒酵母就可以代謝木酮糖生成乙醇等產物，木糖就可以作為碳源進行乙醇發酵。如果能夠有效地將木糖發酵為乙醇，能使木質纖維素乙醇發酵的產量在原有的基礎上增加25％，纖維乙醇生產成本將會降低20％左右。所以木糖發酵產乙醇已成為決定木質纖維素生產乙醇的經濟可行的關鍵因素之一。

木糖異構化所需的木糖異構酶(D-Xylose isomerase，XI，EC 5.3.1.5)催化五碳糖D-木糖轉化為D-木酮糖，廣泛存在于細菌、少部分真菌中。釀酒酵母具有木酮糖代謝的完整酶系，木酮糖進入磷酸戊糖途徑，發酵生成乙醇。如果發現新的可在釀酒酵母里高效表達的木糖異構酶，釀酒酵母就能夠將木糖異構化成木酮糖，達到可利用木糖作為碳源進行乙醇發酵的目的。

現有技術的木糖異構酶基因多來自于微生物。曾有人分別克隆表達了多種來源的木糖異構酶基因，如Escherichia coli，Bacillus subtilis，Thormotoga species，Thermus species等等。但迄今為止只有少數幾種且多為嗜熱細菌的木糖異構酶基因在乙醇生產傳統菌株釀酒酵母中得到活性表達，而且在30℃左右的乙醇發酵溫度下普遍由于活性太低而成為木糖代謝途徑的限速步驟。

發明內容

本發明的目的是從真菌中篩選出新的木糖異構酶基因，并將該基因導入釀酒酵母，使得到的酵母遺傳工程菌獲得將木糖轉化為木酮糖的能力。

本發明所要解決的技術問題如下：

從真菌中篩選出一種新的木糖異構酶基因；

提供包含上述木糖異構酶及其基因的重組載體；

提供包含上述木糖異構酶基因的重組菌株；

將所得上述重組菌株應用于轉化木糖生成木酮糖，進而生成乙醇。

本發明人從天然瘤胃真菌中獲得了一種新的木糖異構酶，命名為XI，并得到了一種編碼該酶的木糖異構酶基因xylA，實驗證明，該基因具有將木糖轉化成木酮糖的功能，適合于在能源、釀酒以及食品工業中使用。

雖然本發明最初是通過篩選到該真菌完成的發明，但本發明的結果是得到了基因序列。他人不依賴這種真菌，只要得知序列就可以獲得本發明的木糖異構酶。

所述木糖異構酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。該xylA基因編碼的木糖異構酶XI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明將上述木糖異構酶基因xylA插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接，得到包含木糖異構酶基因xylA的重組質粒。所述表達載體優選為釀酒酵母多拷貝組成型表達載體pYES-FBA，得到重組質粒pYES-FBA-XI。