[發明專利]一種鑒別太平洋鱈魚皮膠原蛋白的方法

有效

• 申請號: 201711061907.9
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107629113B
• 公開（公告）日: 2023-09-15
• 發明（設計）人: 侯虎;李八方;張燕;趙雪;張朝輝
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K7/08;C07K14/00;C12P21/06;G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明涉及一種使用專屬性肽段組鑒別太平洋鱈魚(Gadus?macrocephalus)魚皮膠原蛋白的方法，以及一組用于通過液相色譜?串聯質譜檢測分析方法鑒定太平洋鱈魚皮膠原蛋白的對照多肽，包含有序列為SEQ?ID?NO.1?7的多肽。所述肽段組中雖有肽段在其他物種中存在，但其他物種中不會同時存在上述7條肽段，上述肽段組為太平洋鱈魚皮膠原蛋白專有肽段組。

技術領域

本發明屬于蛋白分析技術領域，具體涉及一種鑒別太平洋鱈魚皮膠原蛋白的方法。

背景技術

膠原蛋白是多細胞生物中含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質種類之一。膠原蛋白獨特的分子結構、氨基酸組成以及良好的生物相容性和促細胞增殖能力使其在功能食品、化妝品、生物材料以及醫學組織工程等領域中得以廣泛應用。太平洋鱈魚(Gadusmacrocephalus)屬于冷水性底層魚類,為北方沿海出產的海洋經濟魚類之一,其皮膚膠原蛋白含有多種活性肽段，如促鈣吸收活性、抗光老化活性以及提高免疫活性等。因此，其開發應用前景十分廣闊。

不同來源的魚皮膠原蛋白相比較，有的熱穩定性好、機械強度高，有的生物相容性好，抗原性低，有的含有多種活性肽段，如抗光老化活性，增加骨密度活性，降血壓活性等，使得應用方向各有差異。因此對相關產品的區分和鑒別就顯得十分重要。

目前由于采用傳統的電泳、氨基酸分析、紅外光譜以及X-射線衍射等分析方法都無法區別不同來源的膠原蛋白，對相關產品的快速檢測缺乏技術水平的支持，導致不少不良商人以次充好，欺騙消費者，因此需要一種高效準確的鑒定不同來源膠原蛋白的方法。

發明內容

本發明對太平洋鱈魚(Gadus?macrocephalus)魚皮膠原蛋白進行了研究，建立了從多肽水平對太平洋鱈魚皮膠原蛋白來源進行鑒別的技術，從而有效的彌補現有技術的不足。

本發明首先提供用于檢測太平洋鱈魚皮膠原蛋白的多肽組合，包含有如下序列的多肽：

SEQ?ID?NO.1:EGPSGAAGQDGR、

SEQ?ID?NO.2:GESGPAGPSGFAGPPGADGQTGPR、

SEQ?ID?NO.3:GAMGPAGPDGQQGSR、

SEQ?ID?NO.4:VGSPGPYGVGPSGIEGR、

SEQ?ID?NO.5:GESGDTGPK、

SEQ?ID?NO.6:GKPGLPGMPGSDGPPGHPGK、

SEQ?ID?NO.7:GPQGPAGPAGPK；

上述的肽段組用于檢測太平洋鱈魚皮膠原蛋白。

本發明還提供一種鑒別于太平洋鱈魚皮膠原蛋白的方法，包括如下步驟：

1)取凍干膠原蛋白用0.3～0.5mol/L的醋酸溶解，濃度為2～4mg/mL；

2)將膠原蛋白溶液用0.1mol/L?NH₄HCO₃溶液調節pH值為7.0～7.8，在40～50℃條件下處理1.5～2.5h，然后12000×g離心15～25min；

3)取400～1000μL離心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液(酶：底物＝1:25～50，w/w)，于37℃下酶解18～24h；

4)酶解液采用0.22μm的微孔濾膜過濾，用Zip?微量層析柱脫鹽濃縮，待進行液相色譜-串聯質譜聯用分析；

5)液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測分析，分析條件如下：

流動相A：0.1％甲酸-乙腈，流動相B：0.1％甲酸-水；