[發(fā)明專利]用于檢測EGFR基因2319-2320位突變的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711060308.5
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN109722469A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 莫敏俐;丁鳳;陳釗;李暉
• 申請（專利權(quán)）人: 嘉興雅康博醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種用于檢測EGFR基因2319?2320位突變的引物、探針及試劑盒。所述引物如SEQ ID No.1?SEQ ID No.2所示，所述探針如SEQ ID No.3所示。利用本發(fā)明的試劑盒進行實時熒光PCR，可以檢測EGFR基因2319?2320位插入CACCCCCAC堿基突變。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于檢測EGFR基因突變的引物、探針及相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)

惡性腫瘤在中國發(fā)病率近年來呈逐年上升趨勢，每年新增患者達170萬人以上。肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其中80％～85％為非小細胞肺癌(nonsmall celllungcancer，NSCLC)。在我國，肺癌已成為惡性腫瘤第一位死因，5年生存率約15％。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，靶向治療倍受關(guān)注，選擇合適的患者進行靶向治療是其成功的關(guān)鍵，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是目前腫瘤治療的重要靶點。

EGFR基因位于人第7號染色體短臂(7p12)，長約118kb，由28個外顯子組成。其轉(zhuǎn)錄形成的mRNA長約5.6kb，編碼分子量為170kD的跨細胞膜糖蛋白，胞內(nèi)區(qū)具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)活性，負責(zé)將胞外信號傳遞至胞內(nèi)。異常的EGFR活化能夠促進腫瘤細胞的增殖、遷移、分化、血管新生，并且能夠抑制腫瘤細胞的凋亡。

EGFR基因突變主要發(fā)生在胞內(nèi)TK區(qū)域的前4個外顯子上(18～21外顯子)，研究表明：EGFR基因18、19、21外顯子發(fā)生突變的肺癌患者服用酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinase inhibitors，TKIs)類藥物的療效較好，20外顯子發(fā)生的突變常與TKIs耐藥有關(guān)^[1-4]。中國肺癌患者中，EGFR的突變率約為30％～50％，其中18外顯子上發(fā)生的點突變約占EGFR突變類型的5％左右，19外顯子上發(fā)生的多種缺失突變約占EGFR突變類型的45％左右，21外顯子上發(fā)生的L858R、L861Q點突變約占EGFR突變類型的40％～45％，20外顯子上發(fā)生的T790M點突變約占EGFR突變類型的5％左右^[5-6]。

目前Sanger測序法是EGFR基因突變檢測的主要方法。然而，該方法的靈敏度低，會導(dǎo)致漏檢及假陰性的發(fā)生，而且檢測時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。臨床上迫切需要開發(fā)一種高靈敏度、快速的EGFR基因突變檢測技術(shù)。

本發(fā)明的發(fā)明人在胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)的日常檢測中發(fā)現(xiàn)了與胃腸道間質(zhì)瘤有關(guān)的位于EGFR基因的新突變位點，即2319-2320位插入突變。本發(fā)明的發(fā)明人針對該突變開發(fā)了一種快速、高靈敏、操作簡便的檢測試劑盒及相關(guān)的檢測方法，可以用于GIST化療預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于檢測EGFR基因突變的引物和探針，所述突變是2319-2320位插入CACCCCCAC(堿基突變：2319-2320insCACCCCCAC，蛋白突變：H773_V774insHPH)。本發(fā)明的引物與探針包括如下序列：

正向引物(F)：TGGACAACCC CCACCAC(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：GGACATAGTC CAGGAGGCA(SEQ ID No：2)

探針(PB)：TGGGCATCTG CCTCACCTCC A(SEQ ID No：3)

本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測EGFR基因2319-2320位突變的檢測試劑盒，所述試劑盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示的引物和SEQ ID No.3所示的探針。

根據(jù)所采用的PCR方法，本發(fā)明的試劑盒還可以包括內(nèi)參基因和內(nèi)控基因。