[發(fā)明專利]一種基于RT-qPCR法檢測(cè)胃癌的試劑盒及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711058788.1
• 申請(qǐng)日: 2017-11-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107746880B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王家旺;張彬;季加孚;文賢子
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 健生生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種基于RT-qPCR法檢測(cè)胃癌的試劑盒，包括PCR板、qPCR正向引物、qPCR反向通用引物、探針、逆轉(zhuǎn)錄通用引物和內(nèi)參miRNA，其特征在于，所述qPCR正向引物、qPCR反向通用引物和探針同時(shí)包被在PCR板中，所述逆轉(zhuǎn)錄通用引物盛裝在引物試劑管中；

所述內(nèi)參miRNA包括ArtRNA3；所述ArtRNA3具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述逆轉(zhuǎn)錄通用引物包括兩種；一種逆轉(zhuǎn)錄通用引物是摩爾濃度為10μmol/L的檢測(cè)胃癌樣品用逆轉(zhuǎn)錄通用引物，另一種逆轉(zhuǎn)錄通用引物是摩爾濃度為10μmol/L檢測(cè)健康組織樣品用逆轉(zhuǎn)錄通用引物；所述檢測(cè)胃癌樣品用逆轉(zhuǎn)錄通用引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述檢測(cè)健康組織樣品用逆轉(zhuǎn)錄通用引物具有如序列表中SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；

所述探針包括兩種探針，分別為摩爾濃度為10μmol/L的檢測(cè)胃癌樣品用通用探針和摩爾濃度為10μmol/L的檢測(cè)健康組織樣品用通用探針；所述檢測(cè)胃癌樣品用通用探針具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述檢測(cè)健康組織樣品用通用探針具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

所述qPCR反向通用引物具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

所述qPCR正向引物的核苷酸序列同差異表達(dá)miRNA的核苷酸序列；所述差異表達(dá)miRNA包括URS000054A671_9606Homo sapiens hsa-miR-5004-5p、TJU_CMC_MD2.ID01366.5p-miR、TJU_CMC_MD2.ID00936.5p-miR、novel-miR-1373-3p和TJU_CMC_MD2.ID00928.5p-miR中的一個(gè)或多個(gè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述兩種探針采用兩種不同的染料標(biāo)記，分別為FAM熒光探針和VIC熒光探針。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述組分還包括5×聚腺苷酸聚合酶、10mmol/L ATP溶液、25mmol/L MnCl₂溶液、10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、100mmol/L dNTP溶液、核酸酶阻斷劑、2×Taq聚合酶、50×qPCR緩沖液。

4.權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括包被PCR板的制備方法和逆轉(zhuǎn)錄通用引物試劑管的制備方法；

所述包被PCR板的制備方法包括以下步驟：

1)將qPCR正向引物、qPCR反向通用引物、檢測(cè)胃癌樣品用探針和檢測(cè)健康組織樣品用探針用稀釋液分別稀釋成濃度為10、100和100μmol/L的母液；

2)將1600μL的10μmol/LqPCR反向通用引物溶液、400μL的10μmol/L檢測(cè)胃癌樣品用探針溶液，400μL的10μmol/L檢測(cè)健康組織樣品用探針溶液和181.6mL超純水混合，得到總體積為184mL的混合液；

3)向96深孔板的每孔中加入160μL qPCR正向引物和所述步驟2)得到的混合液1840μl，混合，得到2000μL的反應(yīng)體系；

4)將96深孔板分裝到96孔PCR板中，每孔5μL；

5)在陽(yáng)性對(duì)照孔中加入內(nèi)參miRNA至PCR板中；在陰性對(duì)照孔中加入超純水至PCR板中；

6)將所述PCR板進(jìn)行真空干燥，在25～27℃條件下干燥18～24h，得到包被的PCR板；

所述逆轉(zhuǎn)錄通用引物試劑的制備方法，包括以下步驟：

A.將逆轉(zhuǎn)錄通用引物用稀釋液稀釋成10μmol/L的母液；

B.將所述步驟A的母液進(jìn)行分裝，分裝體積為10μL；

C.將分裝母液置于真空干燥環(huán)境中，25～27℃條件下干燥18～24h，得到干燥的逆轉(zhuǎn)錄通用引物。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)和步驟A中的稀釋液為TE緩沖液；所述TE緩沖液包括以下含量的組分：10mmol/L Tris和1mmol/L EDTA；所述TE緩沖液的pH值為8.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，得到包被PCR板和逆轉(zhuǎn)錄通用引物后還包括：將所述制備得到的包被PCR板和逆轉(zhuǎn)錄通用引物分別真空包裝后裝入自封袋中。