[發(fā)明專利]膠質(zhì)瘤預后標志物circ7:66286511|66286709及應用

在審

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• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107604075A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發(fā)明（設計）人: 湯穎;武明花;李沛瑤;劉慶;袁健;趙春花;劉洋
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學湘雅醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/113
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所43114
• 代理人: 袁靖

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于膠質(zhì)瘤預后的circRNA標志物、以及檢測該標志物的試劑用于制備膠質(zhì)瘤預后制劑的應用、還有試劑盒。

背景技術(shù)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性神經(jīng)上皮細胞腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的40.49％，是成人最常見的腦部腫瘤之一。從確診開始，腦膠質(zhì)瘤患者平均生存壽命不超過五年。目前膠質(zhì)瘤的治療技術(shù)多樣，但由于腫瘤浸潤侵襲速度快，以及對放化療介導的細胞凋亡不敏感等特性，總體治療效果不佳，復發(fā)率高，預后差，因此尋找新的治療靶點和預后指標至關(guān)重要。目前膠質(zhì)瘤診斷仍然處于以臨床、病理學和影像學信息為基礎的經(jīng)驗性階段，而且一經(jīng)診斷，絕大多數(shù)均為中晚期，術(shù)后生存率不容樂觀。因此，尋找新的膠質(zhì)瘤預后標志物對患者進行生存分析，以提高膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后生活質(zhì)量，并相應地選擇合理的后續(xù)治療方案，提高生存率，是神經(jīng)科學領(lǐng)域亟待解決研究任務。

circRNA是一類不同于線性RNA，廣泛且多樣地存在于哺乳動物細胞中的內(nèi)源性封閉環(huán)狀非編碼RNA分子，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易受RNA外切酶影響，能在轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后，翻譯等水平多層次調(diào)控基因表達，廣泛存在于各類細胞中，腦部豐度極高。circRNA近年來已成為非編碼RNA領(lǐng)域的新熱點。隨著深度測序技術(shù)的廣泛應用和生物物理和信息學技術(shù)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)人類許多外顯子的轉(zhuǎn)錄本可被非線性地反向剪接或通過基因重排而形成circRNA，且它們在所有剪接轉(zhuǎn)錄本中占了相當大的比例，并具有豐富性、穩(wěn)定性、高保守性和時空特異性等特征，有作為諸多疾病分子標志物的潛力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是：提供一種用于膠質(zhì)瘤患者預后的腦組織來源的CircRNA標志物circ7:66286511|66286709，其序列如SEQ NO:1所示。

本發(fā)明的第二個目的是，提供檢測所述的CircRNA標志物在腦組織中表達量的試劑在制備膠質(zhì)瘤預后制劑中的應用。

本發(fā)明的第三個目的是，提供一種膠質(zhì)瘤預后試劑盒，能夠測定腦組織中的circ7:66286511|66286709的含量。

所述的膠質(zhì)瘤預后試劑盒，含有檢測circ7:66286511|66286709含量的PCR引物。優(yōu)選引物的序列如SEQ NO:2和3所示。

所述的膠質(zhì)瘤預后試劑盒，除circ7:66286511|66286709的引物外，還含有從腦組織中提取RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR的所有試劑。包括：

(1)從膠質(zhì)瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；

(2)以總RNA為模板將circ7:66286511|66286709逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及circ7:66286511|66286709所用隨機引物；

(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括circRNA circ7:66286511|66286709實時熒光定量PCR特異性引物、GAPDH內(nèi)參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水。

申請人通過對40例膠質(zhì)瘤患者瘤組織及15例正常人體腦組織熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)circ7:66286511|66286709在兩者中明顯差異表達(P<0.0001)。并對接受隨訪的18例患者進行生存曲線分析發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織來源的circRNA circ7:66286511|66286709與患者的生存率相關(guān)，其含量越高，生存率越高(P＝0.005)。此法為膠質(zhì)瘤的預后分析提供了強有力的技術(shù)支持，有助于提高膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后生活質(zhì)量，制訂術(shù)后治療方案，提高生存率，具有深遠的臨床意義和推廣性。

附圖說明

圖1為實時熒光定量PCR分析circ7:66286511|66286709在正常腦組織與膠

質(zhì)瘤中的表達差異；

圖2為生存曲線分析膠質(zhì)瘤組織來源的circ7:66286511|66286709表達高低對膠質(zhì)瘤患者的預后影響。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

實施例1制備檢測circRNA circ7:66286511|66286709表達量的試劑用于制備膠質(zhì)瘤患者預后的試劑盒(50次反應)

1.RNA穩(wěn)定溶液 50ml

2.異丙醇 100ml

3.三氯甲烷 100ml

4.Trizol 50ml

5.無酶水 10ml