[發(fā)明專利]一種馬鈴薯晚疫病菌拮抗試驗(yàn)用培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711055271.7
• 申請(qǐng)日: 2017-11-01
• 公開（公告）號(hào): CN107630064A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張艷萍;令利軍;羅俊杰;厚毅清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/18
• 分類號(hào): C12Q1/18;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京挺立專利事務(wù)所(普通合伙)11265
• 代理人: 倪鉅芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬鈴薯晚疫病菌拮抗試驗(yàn)用培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉（Phytophthora infestans (Mont.) de Bary）引起的，在馬鈴薯生產(chǎn)中是一種毀滅性的病害，嚴(yán)重影響著馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，馬鈴薯晚疫病防治主要包括化學(xué)防治、抗病育種等。化學(xué)防治見效快，但是存在農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題；抗病選育在馬鈴薯上的應(yīng)用受到極大的限制，因?yàn)轳R鈴薯的栽培種為同源四倍體無(wú)性繁殖作物，具有高度雜合，遺傳類型復(fù)雜的特點(diǎn)，與多數(shù)二倍體野生種雜交不親和。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展進(jìn)步，利用生物種間關(guān)系、種內(nèi)關(guān)系，調(diào)節(jié)有害生物種群密度的生物防治手段越來(lái)越受到人們的重視，這種生物防治措施具有安全、有效和無(wú)污染等特點(diǎn)，與保護(hù)生態(tài)環(huán)境和社會(huì)協(xié)調(diào)發(fā)展的要求相吻合。

目前，國(guó)內(nèi)外較多學(xué)者Filippov、Jindal K、楊懷文、夏麗琴等都進(jìn)行過(guò)對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的生物防治研究，均取得了較好的防治效果。這些研究為馬鈴薯晚疫病的生物防治奠定了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)，展示了生物防治技術(shù)良好的應(yīng)用前景。在申請(qǐng)人的研究過(guò)程中，因?yàn)轳R鈴薯晚疫病菌的生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基質(zhì)比較特殊，需要在黑麥培養(yǎng)基上才能夠健康生長(zhǎng)，而申請(qǐng)人從土壤中篩選出的一株拮抗性較好的菌株HC5，在黑麥培養(yǎng)基上不能夠產(chǎn)生拮抗分泌物，研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基質(zhì)PDA培養(yǎng)基上能夠較好的產(chǎn)生拮抗分泌物，但是馬鈴薯晚疫病菌在PDA培養(yǎng)基上卻不能夠產(chǎn)生孢子。基于這種特殊性，申請(qǐng)人嘗試著將兩種培養(yǎng)基組合，在這種組合培養(yǎng)基上，馬鈴薯晚疫病菌能夠健康生長(zhǎng)，同時(shí)菌株HC5也能夠較好產(chǎn)生分泌物，使得這一拮抗實(shí)驗(yàn)有效實(shí)施，為馬鈴薯晚疫病菌再遇到此類拮抗菌株的篩選工作提供了一種新的實(shí)用基質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種馬鈴薯晚疫病菌拮抗試驗(yàn)用培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用，此種培養(yǎng)基，既滿足了拮抗菌株HC5產(chǎn)生拮抗分泌物，又滿足了馬鈴薯晚疫病菌的健康生長(zhǎng)，從而使得拮抗實(shí)驗(yàn)得以有效實(shí)施。該培養(yǎng)基首先確定了拮抗菌株HC5是能夠在其上正常產(chǎn)生分泌物的，也確定了馬鈴薯晚疫病菌能夠在其上健康生長(zhǎng)；然后在其上開展拮抗實(shí)驗(yàn)，這樣避免了條件的單一滿足而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真，同時(shí)也避免條件的單一滿足而加大篩選工作或錯(cuò)失有些有效結(jié)果，為馬鈴薯晚疫病菌的拮抗篩選工作提供了一種新的實(shí)用基質(zhì)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種馬鈴薯晚疫病菌拮抗試驗(yàn)用培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

1）PDA培養(yǎng)基制備：

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA的制備方法為，取馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，加水至1L；2）HX培養(yǎng)基制備：

黑麥-西紅柿培養(yǎng)基HX的制備方法為，黑麥60g，西紅柿汁100ml，碳酸鈣0.4g，瓊脂15g，加水至1L；

3）混合培養(yǎng)基制備：

將步驟1）和步驟2）得到的PDA培養(yǎng)基和HX培養(yǎng)基，分別進(jìn)行常規(guī)的培養(yǎng)基高溫高壓滅菌，再在無(wú)菌環(huán)境下，按照體積比1:1的比例將二者混合均勻，即可得到所述馬鈴薯晚疫病菌拮抗試驗(yàn)用培養(yǎng)基。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述一種馬鈴薯晚疫病菌拮抗試驗(yàn)用培養(yǎng)基的制備方法制備得到的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了上述培養(yǎng)基在馬鈴薯晚疫病菌拮抗試驗(yàn)中的應(yīng)用，拮抗試驗(yàn)包括以下步驟：

a）拮抗接種：

在馬鈴薯晚疫病菌拮抗試驗(yàn)用培養(yǎng)基平板中央接入直徑為5-7mm的馬鈴薯晚疫病菌餅，20℃或室溫黑暗生長(zhǎng)一周后，在距中央2-2.5cm處接入浸有活化培養(yǎng)24h的拮抗菌株HC5菌液的直徑為5-7mm的濾紙圓片，20℃或室溫黑暗繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)置不接種菌株HC5的處理為對(duì)照；

b）拮抗結(jié)果統(tǒng)計(jì)：

平板對(duì)峙培養(yǎng)7-10d后測(cè)量病原菌的菌落半徑，計(jì)算抑菌率；計(jì)算公式為：抑菌率=[（對(duì)照菌落半徑－處理菌落半徑）/ 對(duì)照菌落半徑]×100%。。

培養(yǎng)基是微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵，不同的培養(yǎng)基，微生物在上面生長(zhǎng)的狀態(tài)差異很大，直接關(guān)系到后期工作的開展。因此，本發(fā)明反復(fù)進(jìn)行了不同培養(yǎng)基中拮抗菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)和馬鈴薯晚疫病菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，以期解決拮抗實(shí)驗(yàn)中，拮抗菌株HC5拮抗物質(zhì)能否較好分泌，同時(shí)馬鈴薯晚疫病菌能否健康生長(zhǎng)等問(wèn)題。最后確定本培養(yǎng)基，既能滿足拮抗菌株HC5拮抗物質(zhì)能夠較好分泌，同時(shí)馬鈴薯晚疫病菌也能夠健康生長(zhǎng)。這不但避免了條件的單一滿足而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真，同時(shí)也避免了條件的單一滿足而加大篩選工作或錯(cuò)失有些有效結(jié)果。