[發(fā)明專利]茄子品種DNA指紋圖譜及其建立方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711055255.8
• 申請日: 2017-11-01
• 公開（公告）號: CN107760797B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳雪霞;查丁石;朱宗文;張愛冬;李賢
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 上海碩力知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31251
• 代理人: 劉紅梅

1.一種茄子品種DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、茄子基因組DNA的提取

采用CTAB微量法提取茄子基因組DNA并純化；

S2、SSR引物擴增與篩選

用獲得的高純度茄子DNA為模版，利用19對SSR引物對“滬茄五號”雜交品種及其雙親品種的DNA進(jìn)行PCR擴增，篩選出多態(tài)性好的SSR引物；

S3、PCR擴增及產(chǎn)物的電泳檢測

利用篩選出的SSR引物進(jìn)行PCR擴增；PCR擴增產(chǎn)物通過6％的PAGE電泳分離，而后進(jìn)行銀染、顯影、標(biāo)記；

S4、DNA數(shù)字指紋即指紋圖譜的建立

對擴增產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以“1”和“0”分別代表某個等位基因位點擴增出的DNA條帶的有和無，按照從上到下即由小片段向大片段的讀帶方向，將指紋圖譜轉(zhuǎn)換為由“1”和“0”組成的字符串，即構(gòu)成對應(yīng)品種的數(shù)字指紋；

S5、數(shù)字化二維碼的建立

對親本和雜交種的指紋圖譜代碼進(jìn)行二維編碼，錄入每份供試材料的名稱和指紋圖譜代碼信息，繪成親本和雜交種的DNA指紋圖譜二維編碼；

步驟S3中，篩選得到2對特異引物SSR116和SSR171；

引物SSR116堿基序列為：

5'-TTAGAAATTTCGGAACAAAGAGA-3'；

5'-CCACATGAAACTTGGACCAATGAG-3'；

引物SSR171堿基序列為：

5'-CCTTCAATTGACC TCCCTCA-3'；

5'-GCATCTGGAAATTAGAGGCG-3'；

步驟S4中，建立的數(shù)字指紋為：

對于引物SSR116：父本“福-2”為0111111，母本“江茄”為1011111，雜交種“滬茄5號” 為1111111；

對于引物SSR171：父本“福-2”為11111111111，母本“江茄”為11000001100，雜交種“滬茄5號”為11111111111；

其中，所述數(shù)字“1”表示圖譜中某個位置上有擴增帶存在，數(shù)字“0”表示在某個位置上沒有擴增帶存在。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中CTAB微量法采用的CTAB緩沖溶液成分為：

100ml 1M TRIS，pH＝7.5；

140ml 5M NaCl；

20ml 0.5M EDTA，pH＝8；

740ml MiliQ H₂O；

20g CTAB，并在65℃水浴溶解。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟S2及S3中，PCR擴增采用10μL的反應(yīng)體系，使用2×Taq Master Mix稀釋1倍后取8.0μL，0.1μmol/L引物各0.5μL，50ng/μL模板DNA1.0μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2及S3中的PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30min，60℃退火30s，每個循環(huán)降溫0.5℃，72℃延伸45s，9個循環(huán)；94℃變性1min，56℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸10min后4℃保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S5中，將引物按照固定的順序以字母的形式進(jìn)行編號，再對引物擴增條帶大小記錄并賦值，生成相應(yīng)引物及其條帶的帶型編號；

按照固定順序，對每份供試材料帶型編號組合，生成該品種的指紋圖譜代碼，對雙親品種和雜交品種的DNA指紋圖譜代碼分別進(jìn)行二維編碼。

6.權(quán)利要求1所述方法建立的DNA指紋圖譜的應(yīng)用，其特征在于，用于茄子雜交種“滬茄五號”種子純度的鑒定。