[發(fā)明專利]可水解對苯二甲腈制備對氰基苯甲酸的腈水解酶有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201711055153.6 | 申請日： | 2017-11-01 |
| 公開（公告）號： | CN107641622B | 公開（公告）日： | 2021-10-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 姚培圓;于珊珊;張慕姣;馮進輝;吳洽慶;朱敦明;馬延和 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 |
| 主分類號： | C12N9/78 | 分類號： | C12N9/78;C12N15/55;C12P13/00 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 300308 天津*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 水解 二甲 制備 苯甲酸 | ||
本發(fā)明公開了來源于泛菌屬(Pantoea sp.AS?PWVM4)的腈水解酶N1及其基因、擬南芥(Arabidopsis thaliand)的腈水解酶N2及其基因、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis 72W)的腈水解酶N3及其基因、瘦鞘絲藻屬(Leptolyngbya sp.)的腈水解酶N4及其基因、甘藍油菜馬齒莧(Brassica oleracea var.oleracea)的腈水解酶N5及其基因和薺藍(Camelina sativa)的腈水解酶N6及其基因，并利用該腈水解酶作為生物催化劑制備對氨甲基苯甲酸中間體對氰基苯甲酸。以相應(yīng)腈水解酶的靜息細胞可催化100g/L的底物，轉(zhuǎn)化率大于99％，本方法具有反應(yīng)條件溫和、無污染和工藝路線簡單等顯著特點，有較大的工業(yè)應(yīng)用前景。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及基因及其蛋白產(chǎn)物，具體涉及來源于泛菌屬(Pantoea sp.AS-PWVM4)的腈水解酶N1及其基因、擬南芥(Arabidopsis thaliand)的腈水解酶N2及其基因、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis 72W)的腈水解酶N3及其基因、瘦鞘絲藻屬(Leptolyngbya sp.)的腈水解酶N4及其基因、甘藍油菜馬齒莧(Brassica oleracea var.oleracea)的腈水解酶N5及其基因和薺藍(Camelina sativa)的腈水解酶N6及其基因，并利用其生物催化制備對氰基苯甲酸，屬于應(yīng)用微生物與酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)
對氨甲基苯甲酸為一種止血劑，適用于肺、肝、胰、前列腺、甲狀腺、腎上腺等手術(shù)時的異常出血，婦產(chǎn)科和產(chǎn)后出血及肺結(jié)核咯血、痰中帶血、血尿，前列腺肥大出血、上消化道出血等。工業(yè)上主要采用對氰基苯甲酸催化氫化法制備對氨甲基苯甲酸。
文獻報道的對氰基苯甲酸的生產(chǎn)方法主要有三種：以對氨基苯甲酸為原料的Sandmeyer法、以對甲酰基苯甲酸為原料的氨氧化法與鈀催化氰基化法(華西藥學(xué)雜志，2015，30(5)，528～530)，但是，這些方法普遍存在反應(yīng)條件苛刻、氰化試劑存在劇毒、環(huán)境污染大、價格昂貴等問題。
生物催化法相對于化學(xué)法具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、無重金屬污染等優(yōu)勢。1994年，Turner等報道了使用固定化的紅球菌(Rhodococcus sp.)催化對苯二甲腈選擇性水解制備對氰基苯甲酸的方法，但是底物濃度只有25mmol/L，產(chǎn)物的收率為62％(J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 1994,1679～1687)；Meth-Cohn等利用紅球菌AJ270(Rhodococcus sp.AJ270)可以實現(xiàn)60mmol/L底物的轉(zhuǎn)化，收率為81％(J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 1997,3197～3204)。
但是，目前已報道的生物催化合成對氰基苯甲酸的方法中，普遍存在底物濃度低、反應(yīng)時間長、酶催化效率低等問題。
發(fā)明內(nèi)容
針對已報道制備方法中底物濃度低、反應(yīng)時間長、酶催化效率低等問題，本發(fā)明采用基因挖礦的手段，得到的腈水解酶能高效催化對苯二甲腈選擇性水解制備對氰基苯甲酸。該過程具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、無污染和工藝路線簡單等顯著特點。其化學(xué)反應(yīng)式如下：
本發(fā)明所述的腈水解酶N1的基因編碼333個氨基酸殘基，其序列為SEQ ID No.1；N2的基因編碼339個氨基酸殘基，其序列為SEQ ID No.2；N3的基因編碼369個氨基酸殘基，其序列為SEQ ID No.3；N4的基因編碼334個氨基酸殘基，其序列為SEQ ID No.4；N5的基因編碼343個氨基酸殘基，其序列為SEQ ID No.5；N6的基因編碼346個氨基酸殘基，其序列為SEQ ID No.6。
本發(fā)明的具體步驟如下：
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