[發明專利]犬冠狀病毒抗體快速定量檢測卡及使用方法

在審

• 申請號: 201711054378.X
• 申請日: 2017-11-01
• 公開（公告）號: CN107831317A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 吳俊清;章健;吳冠英;王澤洲
• 申請（專利權）人: 杭州微瑞科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種犬冠狀病毒抗體快速定量檢測卡，包括檢測卡外殼和裝配在檢測卡外殼內的試紙條，所述試紙條包括帶壓敏膠的塑料底板，在底板上依次粘貼樣品墊、標記物墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述標記物墊由載體基層和標記物組成，標記物為載體基層上噴涂鑭系熒光檢測微球和鑭系熒光質控微球形成的一層膜，其特征在于：所述硝酸纖維素膜上包被犬冠狀病毒重組抗原為檢測線，包被兔抗雞lgY抗體為質控線，標記物為標記有犬冠狀病毒結構蛋白S的重組抗原的熒光檢測微球和標記雞lgY抗體的熒光質控微球。

2.根據權利要求1所述的犬冠狀病毒抗體快速定量檢測卡，其特征在于：所述犬冠狀病毒結構蛋白是犬冠狀病毒結構蛋白S蛋白，其為多表位表達的重組蛋白。

3.根據權利要求1所述的犬冠狀病毒抗體快速定量檢測卡，其特征在于：所述硝酸纖維素膜上質控線采用的兔抗雞lgY抗體為兔抗雞lgY的lgG。

4.一種制備權利要求2中所述犬冠狀病毒結構蛋白S的方法，其特征在于：采用生物信息學技術（Bioinformatics）對犬冠狀病毒不同亞型毒株的S基因進行比對，確認犬冠狀病毒S蛋白基因序列，設計一對引物，經PCR擴增出目的S基因，將S基因連接到真核表達載體pEGFP-C1上，構建出重組質粒pEGFP-S，之后進行雙酶切鑒定，利用Lipofecta mine 2000（脂質體2000轉染試劑）轉染試劑盒將重組質粒轉染到豬腎細胞PK-15中，通過G418篩選后，在熒光顯微鏡下仍能觀察到部分細胞能夠呈現出綠色熒光，這表明重組融合蛋白pEGFP-S在PK-15細胞中得到了表達，將能夠表達重組融合蛋白的細胞克隆，進一步大量表達并純化犬冠狀病毒結構蛋白S蛋白。

5.一種制備權利要求2中所述犬冠狀病毒結構蛋白S的方法，其特征在于：采用生物信息學技術原理，應用計算機對犬冠狀病毒的結構蛋白S抗原基因進行比對分析，及抗原表位預測，篩選和設計犬冠狀病毒特異性的抗原肽序列，并進行人工化學合成抗原肽。

6.一種權利要求1或2或3或4所述檢測卡的使用方法，其特征在于： 所述檢測卡為定量層析檢測卡，將含有犬冠狀病毒抗體的待測液滴入檢測卡的加樣孔中，層析15分鐘，然后使用層析掃描儀對檢測卡進行掃描，層析掃描儀將掃描所得數據無線傳輸給客戶端，客戶端根據掃描數據計算得出檢測卡上質控線和檢測線的熒光信號強度值，同時客戶端從云平臺獲得被檢測犬冠狀病毒抗體的標準曲線，客戶端根據標準曲線與質控線和檢測線的熒光信號強度值的對照關系計算得出待測液中犬冠狀病毒抗體的含量。

7.根據權利要求6所述的使用方法，其特征在于：所述標準曲線是通過如下方式導入云平臺的，首先制備一批檢測卡，并配制對應的犬冠狀病毒抗體標準品，用檢測卡層析標準品并用層析掃描儀檢測，層析掃描儀將檢測得到的數據處理傳遞給客戶端，客戶端計算得出標準品對應的檢測線和質控線的熒光信號強度值，并根據此數據進行回歸從而得到犬冠狀病毒抗體的標準曲線，客戶端將標準曲線傳輸至云平臺儲存。

8.根據權利要求7所述的使用方法，其特征在于：所述客戶端計算得出的標準曲線形成一個文件，并對應生成條形碼，客戶端通過掃描條形碼可以從云平臺提取該標準曲線。