[發明專利]一種分離鑒別大麗輪枝菌的方法

在審

• 申請號: 201711052868.6
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN107629969A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發明（設計）人: 林玲;張昕;鄧晟
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12Q1/6869;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種分離鑒別大麗輪枝菌的方法，其特征在于：

a、病樣的采集：在黃萎病地中，選擇癥狀典型的重病株；剪取植株的一段主干，去除側枝；裝于紙質信封中或者用紙包好；在信封或報紙上寫明采集地點，采集品種，采集人和采集時間；對病樣進行編號，室溫晾干，4℃保存；

b、病原菌的分離：新鮮的病樣采用火焰灼燒法，在超凈臺中，將剪刀、鑷子分別蘸酒精后，再將酒精燒去，重復兩次，進行消毒；然后將病桿在70％的酒精中浸過后，將酒精燒去，如病桿表皮容易剝離，則將表皮組織撥開，用剪刀剪去；然后將維管束剪成小塊(1cm×2cm)，用鑷子選取小塊變色的維管束組織，移至含有氯霉素的PDA平板上，每個平板4-5個小塊，28℃培養5-7d；如果病桿特別干燥，不適合用火焰灼燒法，則采用次氯酸鈉消毒法，在超凈臺中，將剪刀、鑷子分別蘸酒精后，再將酒精燒去，重復兩次，進行消毒；將病桿用自來水沖洗干凈晾干，如病桿表皮容易剝離，則將表皮組織撥開，用剪刀剪去，再將病桿剪成約1cm×2cm大小的小塊；然后置于70％的乙醇中2-5min后，用無菌水洗滌1次；再將病桿小塊移至4％次氯酸鈉中8-10min，然后用無菌水中洗滌4-5次；用鑷子選取小塊變色的維管束組織，移在含有氯霉素的PDA平板上，每個平板4-5個小塊，28℃培養5-7d；

c、病原菌的純化與保存：在超凈臺中，根據平板中病桿小塊周圍長出菌落的形態，選取菌落邊緣少量菌絲塊接種于PDA平板上，28℃培養3-5d。同時，挑取少量菌絲加入含有1mL無菌水的1.5mL的離心管中，渦旋振蕩1min，取10-20μL涂布在PDA平板中，25℃培養至長出單克隆，挑出單克隆至裝有液體PDA培養基的三角瓶中，25℃，150r/min搖床培養3-7d。取搖好的菌液0.5mL與50％甘油1∶1混合，-70℃超低溫冰箱保存；

d、菌株基因組DNA提?。簩⒒罨缶甑逆咦右壕鶆蛲坎荚阡佊胁ＡЪ埖腜DA平板上，25℃培養5d，從玻璃紙上刮取菌絲體，在吸水紙上壓干，放入2mL離心管中，加入適量石英砂混勻。液氮冷凍后，用電鉆(博世GBM10RE)將菌絲體研磨成細粉狀。采用CTAB法提取菌株基因組DNA；

e、PCR檢測菌株的致病類型：采用Pérez-Artés E等設計的特異性引物，D-1(CAT GTT GCT CTG TTG ACT GG)、D-2(GAC ACG GTA TCT TTG CTG AA)，檢測菌株是否為落葉型菌系，擴增產物大小為550bp；ND-1(CAG GGG ATA CTG GTA CGA GAC G)、ND-2(ATG AGT ATT GCC GAT AAG AAC A)，檢測菌株是否為非落葉型菌系，擴增產物大小為1500bp；PCR擴增的反應液總量為25μL，以稀釋10倍的基因組DNA為模板，退火溫度為58℃；PCR擴增產物在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，于紫外凝膠成像儀上觀察結果；

f、ITS序列PCR鑒定：對于特異性引物D-1/D-2和ND-1/ND-2都PCR檢測不到條帶的菌株，采用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1(TCC GTA GGT GAA CCT GCG G)、ITS4(TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)PCR擴增菌株的rDNA-ITS區段，擴增產物大小為540bp左右；PCR擴增的反應液總量為25μL，以稀釋10倍的基因組DNA為模板，退火溫度為50℃；PCR擴增產物在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，于紫外凝膠成像儀上觀察結果；對PCR產物進行純化和測序，將測序結果在GenBank中進行BLAST比對分析，從而鑒別是否為大麗輪枝菌。