[發明專利]一種頭孢菌素C酰化酶突變體及其在7-氨基頭孢烷酸生產中的應用

有效

• 申請號: 201711051787.4
• 申請日: 2017-10-30
• 公開（公告）號: CN108220276B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 丁雪峰
• 申請（專利權）人: 南京朗恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/84
• 分類號: C12N9/84;C12N15/55;C12Q1/34;C12P35/02
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 劉松

本發明公開了一種頭孢菌素C酰化酶突變體及其在7?氨基頭孢烷酸生產中的應用，屬于酶制備技術領域，包括如下步驟：通過引物A獲取基因序列、重組表達蛋白、檢測酶活和制備7?氨基頭孢烷酸。本發明通過定向進化得到酶活性增強的頭孢菌素C酰化酶突變體，酶活性比野生性頭孢菌素C酰化酶提高5倍以上，三小時底物轉化率達95％?98％，副產物D?7ACA小于0.8％，優于行業內標準，通過使用本蛋白突變體，能有效地制造半合成頭孢菌素類藥物的重要中間體，工藝簡單且得率高，技術可移植性強，只要一般的發酵車間即可投入生產，不需購置特殊設備，易于推廣應用，本發明具有較強的實用性和推廣價值。

技術領域

本發明涉及一種頭孢菌素C酰化酶突變體及其應用，特別是涉及一種頭孢菌素C酰化酶突變體制備方法，屬于酶制備技術領域。

背景技術

目前，7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是醫藥工業生產半合成頭孢菌素類藥物的重要中間體，國內外在工業上多采用化學法由頭孢菌素C鈉(鋅)鹽脫去其側鏈來生產，但化學法存在工藝復雜、成本高等問題，而且還會嚴重污染環境；與化學法相比，酶法裂解可以使生產過程大大簡化，例如：發酵得到的頭孢菌素C不需結晶就可用于酶解，生產過程中沒有用到有毒溶劑，可省掉加保護劑和去保護劑等步驟，產品能夠達到高收率、高質量，同時降低成本和減少污染。因此近年來人們著力進行酶法生產7-ACA的研究。

目前，人們研究較多的是兩步酶法制備7-ACA，首先，頭孢菌素C在通氧氣情況下被D-氨基酸氧化酶(DAAO)催化，產生具有酮基的中間體(keto-7-ACA)和H₂O₂，這個中間體較不穩定，很容易被同時產生的H₂O₂化學氧化脫羧，轉變成戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸(GL-7-ACA)，然后GL-7-ACA在GL-7-ACA酰化酶的作用下脫去其側鏈，生成7-ACA。

目前，國內7-ACA大部分的生產廠家已將7-ACA的生產線由化學法轉換為酶法，7-ACA D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶國內也有廠家大批量生產。雖然，兩步酶法制備7-ACA在生產成本和環境保護方面有優勢，但是從頭孢菌素C到7-ACA的轉化率與化學法相比要低，而且DAAO催化反應難以控制，頭孢菌素C酰基轉移酶(CPC acylase)可以直接把頭孢菌素C轉變到7-ACA(不經過GL-7-ACA等中間產物，因此其轉化率與化學法相當，而且能得到較高質量的7-ACA。

目前，利用CPC acylase生產7-ACA的一步酶法是全新的7-ACA酶法工程，既具有高轉化率和純度，也具有高經濟性和環境保護的優勢，具有生產工藝簡單、設備要求低及生產成本低等優點。但是天然存在的頭孢菌素C酰化酶對頭孢菌素C的催化活性低，僅為GL-7-ACA酰化酶的2-4％，難以實現產業化，故亟需開發出高酶活的頭孢菌素C酰化酶突變體用于產業化生產。

國內企業對于頭孢菌素C酰化酶生產7-ACA工藝的提升上主要包括以下幾個方面：通過定點突變以提高頭孢菌素C酰化酶的活性；對大腸桿菌進行基因敲除，從而消除分解底物的蛋白表達，用以提高7-ACA的產率和純度；頭孢菌素C酰化酶的固定化研究，以縮減生產成本等。前述這些方法雖然使得酶活力在一定程度上有所提高，但是仍然無法滿足工業需求，同時得到的突變型頭孢菌素C酰化酶容易受7-ACA產物的抑制，使7-ACA的產率低，轉化速率低，酶的活性受外界影響較大。

發明內容

本發明的主要目的是為了提供一種頭孢菌素C酰化酶突變體及其在7-氨基頭孢烷酸生產中的應用，通過定向進化得到酶活增強的頭孢菌素C酰化酶突變體，提高酶活性，增強底物轉化率，降低副產物生成率。

本發明的目的可以通過采用如下技術方案達到：

一種頭孢菌素C酰化酶突變體，能夠催化頭孢菌素C生成7-氨基頭孢烷酸，所述頭孢菌素C酰化酶突變體與野生型頭孢菌素C酰化酶相比表現出更高的催化活性，酶活提高約8.6倍。

進一步的，頭孢菌素C酰化酶突變體選自序列SEQ ID NO.1。