[發明專利]以聚電解質球刷為酶結合物載體的酶聯免疫檢測方法

有效

• 申請號: 201711051087.5
• 申請日: 2014-08-11
• 公開（公告）號: CN107843727B
• 公開（公告）日: 2020-01-03
• 發明（設計）人: 徐宏;瞿振元;古宏晨
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 31220 上海旭誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 鄭立

本發明公開了一種酶固定化載體的制備方法及應用，尤其公開了一種利用聚電解質球刷為載體，采用靜電吸附后化學偶聯法實現對酶的固定化，并將制備得到的復合物應用于酶聯免疫檢測。本發明的方法實現了酶的高結合量和高活性，應用于酶聯免疫檢測中，顯著提高酶聯免疫檢測的靈敏度。

本申請是以下申請的分案申請：申請日：2014年8月11日；申請號：201410391019.3；發明名稱“一種酶固定化載體的制備及在免疫分析中的應用”

技術領域

本發明涉及生物材料技術領域，尤其涉及一種酶固定化載體的制備方法及在酶聯免疫分析中的應用。

背景技術

酶的固定化在催化、檢測等諸多領域有廣泛的用途，固定化酶載體能夠在發揮酶的功能的同時實現簡便的分離，從而獲得更加純凈的產物。為了提高催化效率，通常希望載體具有較高的酶結合量，同時能夠較好地保持酶的活性。

酶的固定化通常是借助載體表面與酶的物理吸附或化學反應來實現的。然而，常規載體通常面臨酶結合量低，結合過程對酶的活性影響大等問題，使得固定化酶的催化效率大幅下降。利用聚電解質刷的三維結構能夠固定多層的酶，從而大幅提高酶的結合量。同時，柔性的聚合物鏈能夠更好地保持固定化酶的活性，進一步提高催化活性。

Haupt等在2005年《生物大分子》第6期948-955頁報道用聚電解質球刷，通過靜電吸附的方式結合葡萄糖淀粉酶和β-葡萄糖苷酶，結果表明，兩種酶固定化后的活性基本保持不變。Kudina等在2014年《德國應用化學》第53期483-487頁報道用含有磁核的聚丙烯酸球刷，通過靜電吸附結合纖維素酶進行催化，發現由于聚丙烯酸球刷對酶的高結合量、高活性以及球刷的三維結構增大了載體和基體的接觸面積、酶在球刷內可移動等特點，大幅提高了催化效率。然而，在上述方法中，球刷對酶的結合是可逆的，必須在應用過程中保持鹽濃度和pH值不變，否則會導致酶的釋放。這一缺陷大大限制了這種酶載體的應用領域。

免疫分析技術是一種利用抗原-抗體之間高親和性的特異性結合而建立的高靈敏度檢測方法。酶聯免疫分析(Elisa)是以酶作為檢測標記，將酶的高效催化能力與免疫反應相結合而發展起來的一種常用的免疫分析技術。

疾病的早期診斷對檢測靈敏度提出了更高的要求，提高檢測靈敏度的重要途徑之一是在檢測系統中引入信號放大機制，以納米顆粒或微球作為集群酶的載體是一種重要的放大方法。

在常規酶聯免疫(Elisa)體系中，通常是以酶標記的抗體作為信號分子，它能夠識別待測物并催化底物給出檢測信號。但是，一個抗體通常只能結合1～2個酶，因此，待測物與作為標記的酶之間基本是一一對應的關系，不具有信號放大的效果。而用顆粒代替抗體作為酶的載體可以大幅提高酶結合量，使待測物與酶之間形成一對多的關系，從而顯著放大信號，提高檢測靈敏度。

在基于顆粒的檢測體系中，靈敏度的放大倍數取決于載體對酶的結合量。Nilsson在1989年《免疫學方法雜質》122期273～277頁報道用40nm氧化硅顆粒作為載體，以共價鍵固定辣根過氧化物酶(HRP)和抗體，實現了基于顆粒的免疫檢測。但在該方法中，酶的結合量相對較低(20μg/mg)，并且抗體和酶的結合存在競爭關系，因而在檢測過程中需要加入大量的顆粒(150～300μg)，且只在低濃度的檢測范圍內實現了有限的信號放大(約4倍)。Ke等人2010年《分析生物化學》406期第8-13頁發表的論文中對上述工作進行了改進，采用層層自組裝(LBL)技術，實現了對辣根過氧化物酶(HRP)和抗體的分別結合，提高了酶的結合量，同時克服了酶和抗體在結合時相互競爭的問題。但這一方法過程較為繁瑣，多步的化學修飾和偶聯反應將不可避免地對酶的活性產生影響，削弱了載體的信號放大效果。

上述工作的共同問題在于載體的外表面只能結合單層的酶和抗體，因此結合量相對較為有限，而酶的結合過程通常伴隨著酶活性的大幅下降，進一步制約了載體的信號放大效果。