[發明專利]一種菌株胞外產物的發酵生產方法

在審

• 申請號: 201711046867.0
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107574195A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發明（設計）人: 曹崢;付靜;成梁;朱程琳;鄭緣;游云龍;楊亮;王同意
• 申請（專利權）人: 無錫福祈制藥有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12P19/48
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙)11400
• 代理人: 高之波,儲振

技術領域

本發明涉及生物制藥技術領域，尤其涉及一種菌株胞外產物的發酵生產方法。

背景技術

埃博霉素B(Epothilone)是由粘細菌纖維堆囊菌產生的大環內脂類次級代謝產物，是一種新型的抗腫瘤藥物，其分子式C27H41NO6S，分子量為507.68，分子結構式如下式(1)所示：

1995年Bollag等人發現埃博霉素B有和紫杉醇類似的作用機制，通過促微管聚合作用從而抑制腫瘤細胞的增殖，并且與耐紫杉醇相比，埃博霉素B毒性更小，水溶性更好，對耐藥性細胞的作用更強，抗腫瘤譜更廣等優點，同時化學結構簡單，易于進行化學合成和修飾等。這些特征使得埃博霉素被譽為最具有潛力的抗腫瘤新藥之一，引起了全世界的化學家，生物學家以及藥學家的極大興趣和研究熱情。

在現有技術中，埃博霉素B等胞外產物通常采用發酵法進行制備。但是，目前在發酵制備埃博霉素B的產量非常低，其主要原因在于埃博霉素對生產菌株的毒性和反饋抑制作用較大，從而導致埃博霉素B的產量難以得到顯著提高。此外，采用傳統的發酵法進行埃博霉素B的發酵生成過程中會產生大量的同系物，從而最終得到的產物中埃博霉素B的純度非常底。

慶大霉素(Gentamicin，CM)是由放線菌屬小單孢子菌(Micromonospora purprua)發酵產生的氨基糖苷類光譜抗生素，1963年被美國人Weinstein首次發現，1969年被用于臨床。慶大霉素的作用機理為：抑制細菌蛋白質的合成。GM能影響蛋白胨的合成的許多環節：(1)起始階段，抑制70S啟動復合物的形成；(2)選擇性地與30S亞基上靶蛋白結合(P10)，使mRNA上的密碼錯譯，導致異常的、無功能的蛋白合成；(3)阻礙終止因子(R)與核蛋白體A位結合，使已合成的肽鏈不能釋放并組織70S核蛋白體的解離，最終造成菌體內核蛋白體的耗竭。此外，氨基糖苷類通過離子吸附作用附著于細菌體表面造成細胞膜缺損致細胞膜通透性增加，細胞內鉀離子、腺嘌呤核苷酸、酶等重要物質外漏，從而導致細菌死亡，對靜止期細菌作用最強。

有鑒于此，有必要對現有技術中的埃博霉素B或者慶大霉素B等菌株胞外產物的發酵法進行生產的方法予以改進，以解決上述問題。

發明內容

本發明的目的在于公開一種菌株胞外產物的發酵生產方法，用以實現采用發酵法制備菌株胞外產物的產量，并抑制發酵過程中的產物對菌體的反饋抑制。

為實現上述目的，本發明提供了一種菌株胞外產物的發酵生產方法，包括以下步驟：

步驟(1)：將斜面菌種接種于種子培養基上，并在種子罐上進行培養，溫度為28～35℃，通氣量為1:0.5～1:1.5vvm，罐壓0.03～0.07MPa，轉速為200～300rpm，培養時間72～96h；

步驟(2)：將種子培養基轉接于發酵培養基進行培養，溫度為26～35℃，風量為1:0.5～1:1.5vvm，罐壓0.03～0.07MPa，轉速為200～300rpm，培養時間168～240h；

步驟(3)：在發酵進行至48～72h，啟動分離裝置，含有菌株的發酵培養基透過小分子膜進入分離裝置，分離裝置中的第一型樹脂對菌株胞外產物進行吸附；

步驟(4)：在發酵進行至48～72h，啟動補料裝置，流加補料培養基；

步驟(5)：當發酵結束后，向發酵罐中投加第二型樹脂對菌株胞外產物進行吸附，合并第一型樹脂和第二型樹脂，使用乙酸乙酯進行解析。

作為本發明的進一步改進，所述步驟(1)中所述種子培養基的組成為：馬鈴薯淀粉0.8～2.0g/L，葡萄糖0.1～0.5g/L，酵母抽提物0.1～0.5g/L，黃豆餅粉0～1.6g/L，硫酸鎂0.05～0.2g/L，大豆蛋白胨0.2～0.8g/L，玉米粉0～1.2g/L，硝酸鉀0～0.06g/L，氯化鈣0.05～0.2g/L，蛋白胨0～0.3g/L，CaCO₃ 0～0.5g/L，余量為水，種子培養基的pH為7.0～8.0。