[發明專利]用于潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體的多重檢測的核酸、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201711046205.3
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107541560B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 李偉;張翠萍
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京易捷勝知識產權代理事務所(普通合伙) 11613
• 代理人: 齊勝杰

1.一組用于多重PCR同時檢測三種病原菌的核酸，其特征在于，包括用于檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體的上、下游引物，其中，所述潰瘍病菌的上游引物序列如SEQID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

所述褐斑病菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；

所述叢枝病植原體的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ IDNo.10所示。

2.一組用于熒光定量PCR同時檢測三種病原菌的核酸，其特征在于，包括如權利要求1中所述的用于檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體的上、下游引物和各病原菌對應的探針，

所述潰瘍病菌的探針序列如SEQ ID No.3所示；

所述褐斑病菌的探針序列如SEQ ID No.7所示；

所述叢枝病植原體的探針序列如SEQ ID No.11所示。

3.如權利要求1或2所述的核酸，其特征在于，該組核酸還包括檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體的陽性擴增產物，其中，

所述檢測潰瘍病菌的陽性擴增產物如SEQ ID No.4中第29-194bp之間所示的序列；

所述檢測褐斑病菌的陽性擴增產物如SEQ ID No.8中第20-213bp之間所示的序列；

所述檢測叢枝病植原體的陽性擴增產物如SEQ ID No.12中第2-134bp之間所示的序列。

4.一種用于熒光定量PCR同時檢測三種病原菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：如權利要求2中所述的用于檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體的上、下游引物和相應的探針，各條探針的5'端和3'端分別對應標記FAM-BHQ1、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體的陽性擴增產物，其中，

所述檢測潰瘍病菌的陽性擴增產物如SEQ ID No.4中第29-194bp之間所示的序列；

所述檢測褐斑病菌的陽性擴增產物如SEQ ID No.8中第20-213bp之間所示的序列；

所述檢測叢枝病植原體的陽性擴增產物如SEQ ID No.12中第2-134bp之間所示的序列。

6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括Premix EX TaqTM×2。

7.一種用于熒光定量PCR同時檢測三種病原菌的檢測方法，其特征在于，該方法用于檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體這三種病原菌，具體包括以下步驟：

(1)從樣品中提取DNA；

(2)對提取的所述DNA進行熒光定量PCR擴增；其中，熒光定量PCR擴增時，在反應體系中，采用所述潰瘍病菌的上、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，其探針5'端和3'端分別對應標記FAM和BHQ1；所述褐斑病菌的上、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，其探針5'端和3'端分別對應標記JOE和TAMRA；所述叢枝病植原體的上、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，其探針5'端和3'端分別對應標記CY5和BHQ3；

(3)收集熒光信號，選擇步驟(2)中的熒光基團的熒光檢測模式，基線調整取3～15個循環的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；

(4)結果判定：待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈現良好的對數增長，則判斷為陽性，如無典型的擴增曲線，判斷為陰性。