[發(fā)明專利]一種豬圓環(huán)病毒2型與3型PCR鑒別診斷試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711044872.8
• 申請(qǐng)日: 2017-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN107586887B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳旭錦;朱小甫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 西安睿通知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 61218
• 代理人: 惠文軒

本發(fā)明提供了一種豬圓環(huán)病毒2型與3型PCR鑒別診斷試劑盒，包括裂解液、擴(kuò)增反應(yīng)混合液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照；裂解液的成分為DNAiso Reagent；擴(kuò)增反應(yīng)混合液包含滅菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PCV2?F上游引物、PCV2?R下游引物、PCV3?F上游引物、PCV3?R下游引物和rTaq DNA聚合酶；陰性對(duì)照為滅菌三蒸水；陽性對(duì)照為PCV2和PCV3陽性質(zhì)粒混合物。該豬圓環(huán)病毒2型與3型PCR鑒別診斷試劑盒靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高，其檢測(cè)方法易于操作、方便快捷，能大幅縮短檢測(cè)時(shí)間，能徹底解決PCV2、PCV3引起的類似癥狀但病原不同的診斷問題，適合豬場(chǎng)快速檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型與3型PCR鑒別診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是一種重要的豬病病原，PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)、懷孕母豬繁殖障礙和新生仔豬A2型先天性震顫(CT)。1991年Clark首次報(bào)道了加拿大豬群中存在PMWS，隨后世界許多國(guó)家和地區(qū)均報(bào)道了該病的發(fā)生和流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今為止，各國(guó)學(xué)者針對(duì)PCV2建立了多種檢測(cè)方法，對(duì)調(diào)查PCV2的感染流行情況起到了重要作用。

病毒的分離需要采集病死豬的組織，研磨、凍融、離心后取上清接種于細(xì)胞，如無PCV污染的PK-15、豬睪丸細(xì)胞(ST)或Dulac細(xì)胞等。由于病毒在培養(yǎng)細(xì)胞上不出現(xiàn)細(xì)胞病變，在病料接種3d后，可通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、免疫組織化學(xué)染色法(IHC)、PCR等確認(rèn)病毒。但病毒分離所需時(shí)間較長(zhǎng)，不宜作為疾病的快速診斷方法。

免疫熒光試驗(yàn)包括直接免疫熒光試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)，這兩種方法均可對(duì)用細(xì)胞分離的PCV病毒進(jìn)行鑒定，也可對(duì)病理組織冰凍切片細(xì)胞內(nèi)有無PCV進(jìn)行檢查和定位。免疫熒光試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，適合作為快速診斷的試驗(yàn)方法。

免疫組化技術(shù)是應(yīng)用標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，可對(duì)組織或細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行定性、定量和定位。常用的技術(shù)有：酶免疫組化(用辣根過氧化物酶標(biāo)記)、免疫金組化(用膠體金顆粒標(biāo)記)和免疫電鏡技術(shù)(用鐵蛋白、膠體金、過氧化物酶標(biāo)記)等。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起與發(fā)展，PCR技術(shù)以其快速、敏感、易于操作等優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)物疫病診斷中得到了廣泛應(yīng)用。參照GenBank已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCV2特異引物，如果能從患病豬的病料中擴(kuò)增PCV2特異的基因組片段，就可以證明存在PCV-2的感染。

2016年，Palinski等首次鑒定并命名豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)。同年3月，在中國(guó)遼寧、江西、重慶的3個(gè)豬場(chǎng)檢測(cè)出了PCV3病原。研究認(rèn)為，PCV3是一種與母豬皮炎腎病綜合征和繁殖障礙相關(guān)的病原，但目前尚未清楚其起源，是否早已存在于豬體中只是未被發(fā)現(xiàn)，還是通過跨物種傳播或通過PCV間的重組而形成，仍有待進(jìn)一步探究。自2016年以來，我國(guó)部分省(市)相繼出現(xiàn)以母豬流產(chǎn)和死亡、斷奶仔豬呼吸衰竭和死亡為臨床特征的PCV3感染報(bào)道。國(guó)內(nèi)有研究從廣西腹瀉病死仔豬的病料樣品中檢測(cè)出PCV3，表明PCV3不但引起母豬皮炎腎病綜合征與繁殖障礙，還能引起仔豬腹瀉。由于PCV3是新發(fā)豬群病毒病，目前未見快速檢測(cè)PCV3病原的公開報(bào)道。由于PCV2和PCV3引起豬群發(fā)病的癥狀類似，因此，發(fā)明一種快速鑒別PCV2或PCV3感染的診斷試劑盒，為臨床快速確診相應(yīng)疾病，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型與3型PCR鑒別診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，該豬圓環(huán)病毒2型與3型PCR鑒別診斷試劑盒靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、結(jié)果直觀，其檢測(cè)方法易于操作、方便快捷，能大幅縮短檢測(cè)時(shí)間，為臨床控制PCV2和PCV3感染提供有力的技術(shù)手段。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。