[發明專利]一種磁納米顆粒及其制備方法與在病原菌檢測中的應用

在審

• 申請號: 201711043711.7
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107557428A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 李永強;嚴榮;王彥浩;陳愛紅;邵世龍
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12Q1/04
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 常亮

技術領域

本發明涉及細菌檢測技術領域，尤其涉及一種磁納米顆粒及其制備方法與在病原菌檢測中的應用。

背景技術

細菌是一類重要的病原體，它們侵入機體后會分泌產生大量的生物毒素，從而破壞機體的結構和功能，造成宿主感染。菌血癥、敗血癥、全身炎癥反應綜合征、膿毒癥等都是由于致病菌感染導致的疾病、其中，膿毒癥是由血液細菌感染所引發的一種嚴重病癥，全球每年有超過1800萬的膿毒癥病例，而且膿毒癥的病情兇險，會引起機體多個器官的衰竭，除早期診斷并及時采用有效的抗菌藥物治療可獲痊愈外，膿毒癥患者的死亡率高達30～50％。

造成血液細菌感染的致病菌主要包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、鮑氏不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌等。由于感染早期血液中細菌的數目比較少(10～100個/毫升)，且血液中含有大量的細胞(紅細胞、白細胞及血小板)和蛋白，因此對血液中細菌的進行有效富集是實現血液細菌感染快速檢測的前提。

目前，血液細菌感染的檢測技術主要有血液細菌分離培養法和聚合酶鏈式反應法。血液分離細菌培養是目前用于血液細菌感染的最常用方法，主要通過對待測血液樣本進行細菌分離培養，然后再依據長出菌落的形態及生化特征來完成待檢血液樣品的分析檢測。血液分離細菌培養周期太長，不利于病患的早期治療。另一種目前常用的快速檢測方法是聚合酶鏈式反應(PCR)法，其是利用分子生物學技術針對細菌的特異性DNA進行擴增和分型來實現血液細菌感染的分析檢測。雖然相較血液分離細菌培養，PCR方法很大程度的縮短了周期，但由于涉及樣品的前處理步驟其檢測時間仍不夠短，且檢測結果易收到血液中其他組分的干擾。

可見為開展血液細菌感染的早期診斷，保護人民的身體健康，進一步，研究血液細菌感染的快速檢測技術具有非常重要的意義。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種磁納米顆粒及其制備方法與在病原菌檢測中的應用。本發明提供的磁納米顆粒修飾有靶向核酸適配體，能夠快速、準確的對細菌進行定性和定量分析。

本發明提供的磁納米顆粒，包括包裹有聚陽離子電解質的四氧化三鐵納米顆粒和修飾在所述納米顆粒表面的羧基化聚乙二醇和靶向核酸適配體。

本發明提供的磁納米顆粒中，

所述四氧化三鐵納米顆粒的粒徑為15nm～30nm；

所述聚陽離子電解質為聚丙烯氯化銨(PAH)、聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)、聚乙烯亞胺(PEI)等，分子量為10000～20000。

所述羧基化聚乙二醇的分子量為3000～8000。

所述靶向核酸適配體的5’端連接有-COOH。

本發明采用的四氧化三鐵納米顆粒的粒徑為15nm～30nm；修飾后，粒徑變化不大，相對于現有商品化的微米級四氧化三鐵磁珠而言，本發明采用的磁珠的比表面積更大，可以大大提高其負載的核酸適配體的數量，進而增強其對細菌的識別效率。另一方面，這一尺寸的納米磁顆粒的磁效應也并沒有因為尺寸的縮小受到很大影響。

本發明采用的四氧化三鐵納米顆粒采用熱分解法制備。

本發明中其制備方法為：

步驟1：將氯化鐵和油酸鈉溶解于無水乙醇、去離子水和正己烷的混合液，70℃回流4h后，收集有機相洗滌后旋蒸2h去除正己烷，制得油酸鐵；

步驟2：將油酸鐵溶解于十八烯中，加入油酸鈉，氮氣保護下320℃回流30min；冷卻至室溫后，以異丙醇沉淀后，以正己烷分散；

步驟3：將正己烷分散的產物與等體積無水乙醇混合，磁鐵分離后沉淀與四甲基氫氧化銨混合，振蕩后加入異丙醇，再次以磁鐵分離后，沉淀以去離子水洗三次，再以去離子水分散，獲得四氧化三鐵納米顆粒懸液。

步驟1中所述無水乙醇、去離子水和正己烷的混合液中，無水乙醇、去離子水和正己烷的混合液的體積比為20:15:35。

步驟1中所述氯化鐵和油酸鈉的質量比比為0.3:1。

步驟2中，所述油酸鐵、十八烯與油酸鈉的質量比為225:625:38。

本發明通過靜電作用將聚陽離子電解質包裹到四氧化三鐵納米顆粒表面，然后聚陽離子電解質中的氨基與聚乙二醇的羧基或靶向核酸適配體的羧基反應，通過共價偶聯的方法將羧基化的聚乙二醇和靶向核酸適配體修飾到磁納米顆粒上。本發明實施例中，所述聚陽離子電解質的分子量為10000～20000。一些實施例中，所述聚陽離子電解質的分子量為15000。一些具體實施例中，所述聚陽離子電解質為分子量為15000的聚丙烯氯化銨。