[發明專利]用于牛黃真偽鑒別的熒光定量PCR檢測的方法和用途

有效

• 申請號: 201711041967.4
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107881243B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 張文娟;魏鋒;馬雙成
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京攀騰專利代理事務所(普通合伙) 11374
• 代理人: 彭蓉;陳纖

本發明涉及一種用于牛黃真偽鑒別的熒光定量PCR檢測的探針引物及檢測方法，能夠用于對牛黃類藥材、成方制劑及其他相關產品進行真偽鑒定。本發明還提供了探針引物用于牛黃真偽鑒別的熒光定量PCR檢測的用途，所述探針引物為SEQ ID NO：1?3、4?6、7?9、10?12、13?15和/或16?18所示的探針引物組。所述方法采用熒光定量PCR探針法，檢測樣品中應有的動物源性成分和不應有的動物源性成分。應用于牛黃類藥材、成方制劑及其它相關產品的質量控制，所述方法特異性強、靈敏度高、重復性好。

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，涉及藥物鑒別檢測方法，尤其涉及一種用于牛黃真偽鑒別的熒光定量PCR檢測的探針引物及檢測方法。

背景技術

天然牛黃為牛科動物牛(Bos taurus domesticus Gmelin)的干燥膽結石，主要含有膽紅素、膽汁酸、膽固醇、無機元素、蛋白質及氨基酸等成分，具有清心開竅、涼肝解毒、豁痰息風等功效，是名貴中藥材之一[1-2]。由于其資源緊缺，價格昂貴，我國于20世紀50年代中期即開始了替代品即培植牛黃、體外培育牛黃與人工牛黃的研究。

培植牛黃是利用活牛體，以外科手術的方法在牛的膽囊內插入致黃因子，使之生成牛黃。體外培育牛黃是根據膽紅素鈣結石體內形成的原理和生物化學過程，應用現代生物工程技術，在體外牛膽囊膽汁內模擬體內膽結石形成的原理和生物化學過程，培育牛膽紅素鈣結石。人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成。

由于人工培植牛黃是在與天然牛黃相同的特定生態因素條件下形成的，經測定其理化特性、性味、色澤、藥效成分含量等與天然牛黃無明顯差異。而體外培育牛黃在性狀、結構、成分和主要成分含量方面與天然牛黃類似。人工牛黃則與天然牛黃差異較大[3-7]。

牛黃在成方制劑中應用廣泛，資源短缺，特別是天然牛黃和培植牛黃，生產周期長，產量低，屬于珍貴稀有的藥材，近來市場上屢屢曝出摻偽造假的情況。為了防止此類現象的發生，迫切需要開發新的檢測手段，加強監管，對牛黃類藥材的質量進行更好的控制。

發明內容

本發明首次建立了一種用于牛黃真偽鑒別的熒光定量PCR檢測的探針引物及檢測方法，其能夠用于牛黃類藥材及其相關產品的鑒定。

一方面，本發明提供了一種用于牛黃真偽鑒別的熒光定量PCR檢測方法，包括下述步驟：

稱取牛黃樣品及樣品前處理；

從所述樣品中提取DNA并制備DNA模板；及

選擇探針引物；

優化反應條件；

利用所述探針引物對所述DNA模板進行擴增；

針對擴增結果，根據設定的CT值臨界點判定陽性結果；

其中，所述方法能夠用于檢測所述樣品中應有的牛源性成分和不應有的包括豬、馬、驢、羊等其他動物來源成分。

在一些實施方式中，所述探針引物選自下述組群中的一組或多組：序列號為SEQID NO 1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18的探針引物。其中每組探針引物包括三個序列，并且當任何一組用于檢測時其中所包括的三個序列是同時使用而不拆分。

在另一些實施方式中，所述探針引物為序列號為SEQ ID NO 13-15和/或16-18的探針引物。在另一些實施方式中，所述探針引物為序列號為SEQ ID NO 1-3、4-6、7-9和/或10-12的探針引物。

在本發明的一種實施方式中，所述樣品為牛黃類中藥材或含有牛黃的成方制劑。

在本發明的一種實施方式中，所述提取DNA的步驟采用紫外分光光度法進行定量和純度測定。