[發明專利]人輪狀病毒導致病理損傷和腹瀉乳鼠動物模型的建立方法

在審

• 申請號: 201711041820.5
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107550943A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 樊可
• 申請（專利權）人: 山東亦度生物技術有限公司
• 主分類號: A61K35/76
• 分類號: A61K35/76;C12N7/00;C12Q1/70
• 代理公司: 山東濟南齊魯科技專利事務所有限公司37108
• 代理人: 鄭向群

1.人輪狀病毒導致病理損傷和腹瀉乳鼠動物模型的建立方法，其特征在于:所述建立步驟為：

1）隨機選擇體重為3.5g-5.0之間的SPF級別4-5日齡NIH乳鼠為實驗動物，實驗前，采集糞便，采用膠體金法進行輪狀病毒抗原檢測；

2）選取結果為陰性4-5日齡NIH乳鼠10只設定為模型組，每只乳鼠分別采用高壓滅菌的自制小鼠灌胃針一次性經口腔灌入0.2ml 人源輪狀病毒離心收獲液；

3）選取結果為陰性4-5日齡NIH乳鼠10只設定為對照組，每只乳鼠分別采用高壓滅菌的自制小鼠灌胃針一次性經口腔灌入0.2ml Vero細胞凍融后離心上清液；

4）模型組的10只乳鼠在灌入輪狀病毒8h后，出現黃色軟便，肛門口有稀便痕跡，用無菌棉簽收集糞便于無菌試管中，用金標法檢測糞便中輪狀病毒抗原，結果均呈陽性，定義為乳鼠感染輪狀病毒，實驗模型建模成功；

5）之后1～4天，連續采集乳鼠糞便進行輪狀病毒抗原檢測；對照組的乳鼠，用金標法檢測糞便中輪狀病毒抗原，結果均呈陰性。

2.根據權利要求1所述的人輪狀病毒導致病理損傷和腹瀉乳鼠動物模型的建立方法，其特征在于:乳鼠選用產仔率和存活率也較高的NIH小鼠。

3.根據權利要求1所述的人輪狀病毒導致病理損傷和腹瀉乳鼠動物模型的建立方法，其特征在于:乳鼠飼養方式為飼喂輻照滅菌的飼料和高壓滅菌的飲用水。

4.根據權利要求1所述的人輪狀病毒導致病理損傷和腹瀉乳鼠動物模型的建立方法，其特征在于:乳鼠在灌胃前后分別禁奶至少2小時。

5.根據權利要求1所述的人輪狀病毒導致病理損傷和腹瀉乳鼠動物模型的建立方法，其特征在于:輪狀病毒為G1P[8]型人源輪狀病毒WA株。

6.根據權利要求1所述的人輪狀病毒導致病理損傷和腹瀉乳鼠動物模型的建立方法，其特征在于:所述Vero細胞在含10%類胎牛血清，IMDM培養液中生長成單層。

7.根據權利要求1或5或6所述的人輪狀病毒導致病理損傷和腹瀉乳鼠動物模型的建立方法，其特征在于:

所述輪狀病毒還包括擴增方法如下：

1）Vero細胞在培養瓶中生長至單層時接種人輪狀病毒：將人源輪狀病毒WA株從-60℃冰箱中取出，室溫溶解；將長成單層的Vero細胞用pH為7.2的無菌PBS潤洗2次，接種病毒液，并加入含有胰蛋白酶的病毒維持液，36.5℃ 5%二氧化碳孵育2h后，棄去病毒液，PBS潤洗兩次，加入含胰蛋白酶的、無血清的IMDM培養液；

2）然后放入36.5℃、5%二氧化碳中培養并觀察，至病毒感染Vero細胞病變達到+++～++++時，將培養瓶放入-60℃凍存，再4℃融解，如此反復凍融5次，室溫4000rpm離心15min，取上清液；

3）再采用以上方法擴大培養一次，收獲足量離心后病毒收獲液，混勻后分裝至15ml離心管，-60℃保存。

8.根據權利要求1或5或6或7所述的人輪狀病毒導致病理損傷和腹瀉乳鼠動物模型的建立方法，其特征在于:

所述病毒滴度測定方法為：

1）用不含血清的IMDM培養液將其病毒按照1：10系列稀釋成10^-1、10^-2、10^-3.…10^-8等8個濃度梯度，將培養成單層Vero細胞的96孔板用PBS潤洗2次，再將不同稀釋度的病毒加入到96孔細胞培養板中；

2）放入36.5℃、5%二氧化碳中孵育2h后吸出病毒液，加入不含血清的細胞培養液，200uL/孔；放入36.5℃、5%二氧化碳中孵育，連續觀察；

3）當能夠出現細胞病變CPE的最低稀釋度的病毒孔中不再繼續出現CPE時，計數每個稀釋度出現CPE的細胞孔數，按照Reed-Munch方法計算病毒的TCID₅₀。