[發(fā)明專利]具有抗抑制活性的重組木聚糖酶XynB及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711041119.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107619823A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莫毅;梁方方;蔣和生;葉健;郭亞芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 梁方方
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;A23K20/189;A23K10/30;A23K30/18
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙)44295
• 代理人: 王洪娟,馬赟齋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及木聚糖酶XynB及其應(yīng)用，尤其涉及具有抗抑制活性的重組木聚糖酶XynB及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

青貯作為一種保存越冬飼料作物青綠多汁的傳統(tǒng)方式，是以新鮮的青綠飼料為原料，利用植物表面自然附生的乳酸菌，在密閉條件下，通過(guò)厭氧發(fā)酵，將植物表面的可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致飼料pH降低，來(lái)抑制腐敗微生物菌群的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到保持作物的營(yíng)養(yǎng)特性的目的。木聚糖作為一種多聚五碳糖，是植物細(xì)胞壁中的主要結(jié)構(gòu)非淀粉多糖，是植物半纖維素的重要組成部分，占植物碳水化合物總量的三分之一，在自然界中是繼纖維素之后含量第二豐富的再生物質(zhì)資源。但在青貯發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌不能分解植物的半纖維素，而微生物木聚糖酶卻能水解木聚糖生成長(zhǎng)度各異的木寡糖，對(duì)半纖維素降解起著關(guān)鍵作用，其能大幅度提高木質(zhì)纖維素物質(zhì)的利用效率，因此在飼料工業(yè)、食品工業(yè)和造紙工業(yè)中具有巨大的應(yīng)用前景。如在制作青貯飼料過(guò)程中添加木聚糖酶，木聚糖酶就能把植物中的半纖維素成分降解轉(zhuǎn)化為小分子的單糖、寡糖，不僅便于牲畜的吸收利用，還能為青貯過(guò)程中，乳酸菌的發(fā)酵提供營(yíng)養(yǎng)。水稻、玉米、小麥等谷物作物中存在抑制木聚糖酶活性的木聚糖酶抑制蛋白，能對(duì)木聚糖酶的應(yīng)用產(chǎn)生負(fù)面影響。為了進(jìn)一步提高該類飼料的青貯品質(zhì)，在青貯過(guò)程中添加抗抑制活性木聚糖酶是非常必要的，且具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

研究表明小麥等谷物作物中存在能抑制木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)成分，稱為木聚糖酶抑制蛋白。1997年，內(nèi)切木聚糖酶抑制蛋白首次在小麥中發(fā)現(xiàn)(Debyser et al.,1997)。2005年，木聚糖酶抑制蛋白首次在水稻中發(fā)現(xiàn)(Goesaert et al.,2005)。木聚糖酶抑制蛋白還在黑麥、大麥、玉米和高粱等谷物中都有發(fā)現(xiàn)。木聚糖酶抑制蛋白按結(jié)構(gòu)分為三大類：XIP型木聚糖酶抑制蛋白、TAXI型木聚糖酶抑制蛋白和TLXI型木聚糖酶抑制蛋白(Debyser et a1.,1997；Fierens et a1.,2007；MeLauchlan et a1.,1999)。谷物作物整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都存在木聚糖酶抑制蛋白，且木聚糖酶抑制蛋白存在谷物的各組織中，如根、芽、葉及發(fā)育和萌芽的谷物等(侯春曉,2014；王明道等,2010；Xin et a1.,2014)。這就對(duì)木聚糖酶應(yīng)用領(lǐng)域中酶功效的發(fā)揮提出了挑戰(zhàn)：抑制蛋白的存在是否影響外加木聚糖酶的作用？據(jù)估算(Gebruers et a1.,2005)，小麥面粉中抑制蛋白的含量遠(yuǎn)大于應(yīng)用過(guò)程中外加木聚糖酶在其中的比例。而小麥基礎(chǔ)飼糧中抑制蛋白也影響了對(duì)抑制蛋白敏感的木聚糖酶添加劑的作用(Perez-Vendrell et a1.,2003)。因此，我們應(yīng)當(dāng)足夠重視木聚糖酶抑制蛋白對(duì)木聚糖酶應(yīng)用領(lǐng)域產(chǎn)生的負(fù)面作用。令人值得欣喜的是，研究表明木聚糖酶抑制蛋白能抑制外源木聚糖酶的活性(尤其是細(xì)菌等來(lái)源的)，但卻無(wú)法抑制植物內(nèi)源木聚糖酶的活性(Dornez et a1.,2010)。但是，直接從植物中提取分離木聚糖酶，需要耗費(fèi)大量植物，而且工藝復(fù)雜，所得木聚糖酶活性也不理想。然而目前，對(duì)于植物內(nèi)源性木聚糖酶的克隆和表達(dá)研究還相對(duì)較少。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的之一在于提供一種具有抗抑制活性的重組木聚糖酶XynB。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：具有抗抑制活性的重組木聚糖酶XynB，由以下構(gòu)建方法制得：取小麥全基因組，并采用以下特異引物擴(kuò)增小麥的Xyn B基因第三外顯子內(nèi)的活性位點(diǎn)序列，電泳切膠回收DNA片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR V和EcoR I酶切后與載體pET30a+構(gòu)建重組表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化菌轉(zhuǎn)化后獲得重組質(zhì)粒pET30a-Xyn B，重組質(zhì)粒

pET30a-Xyn B轉(zhuǎn)化至工程菌，經(jīng)培養(yǎng)后獲取單克隆菌落，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基中培養(yǎng)并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，獲得重組木聚糖酶XynB；其中，所述的特異引物為：

正向引物：5’-TCGATATCATGCAGCTGGACAACGCCTT-3’，劃線部分為EcoR V限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，

反向引物：5’-TCGAATTCTGCGTCCGTCTTCCACTCCC-3’，劃線部分為EcoR I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

本發(fā)明所述的重組木聚糖酶XynB的分子量為33.497kDa。

本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供上述重組木聚糖酶XynB的應(yīng)用，具體地，提供了上述重組木聚糖酶XynB在飼料中的應(yīng)用，尤其是在青貯飼料中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：