[發(fā)明專利]一種基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711037227.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107807188B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-02-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李勇;逄濤;師君麗;孔光輝;吳玉萍;陳萍;趙立紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 53116 昆明知道專利事務(wù)所(特殊普通合伙企業(yè))
• 代理人: 張玉;謝喬良

1.一種基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于包括以下步驟：

1）樣品前處理：準(zhǔn)確稱取煙葉樣品粉末于離心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作為提取劑，其中所述的甲醇-甲基叔丁基醚-水的體積比為30~40:40~50:65~75，然后超聲，離心，取下層清液，加入內(nèi)標(biāo)溶液，離心濃縮去掉溶劑，加入乙腈復(fù)溶，復(fù)溶液轉(zhuǎn)入液相色譜進(jìn)樣小瓶，待分析；

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以甲醇為溶劑，配置10μg/mL 的馬來(lái)酰肼及其糖苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別移取10、20、40、80、150、200μL 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液至離心管，再分別稱取不含馬來(lái)酰肼及其糖苷的煙葉樣品粉末至離心管作為樣品基質(zhì)，當(dāng)所述的煙葉樣品粉末為烤后煙葉樣品粉末時(shí)，稱取量為10mg；當(dāng)所述的煙葉樣品粉末為新鮮煙葉樣品粉末時(shí)，稱取量為100mg；制成不同濃度梯度的待測(cè)樣本，離心濃縮，除去樣品中的甲醇溶劑；然后按照步驟1）中所述的樣品前處理進(jìn)行處理，再轉(zhuǎn)至液相色譜-高分辨質(zhì)譜進(jìn)行分析，得到每個(gè)濃度梯度樣本對(duì)應(yīng)的色譜質(zhì)譜相對(duì)內(nèi)標(biāo)的峰面積；將得到的相對(duì)峰面積和其對(duì)應(yīng)的濃度梯度進(jìn)行線性擬合，得到校準(zhǔn)曲線方程和線性相關(guān)系數(shù)；

3）樣品分析：將步驟1）處理后的待分析樣品進(jìn)行液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析，將得到的馬來(lái)來(lái)酰肼及其糖苷的色譜質(zhì)譜峰相對(duì)面積輸入校準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)濃度；

步驟2）和3）中所述的色譜分析條件為：色譜柱為100mm×2.1mm×1.7μm 的WatersACQUITY UPLC@BEH HILIC，A相洗脫溶劑為0.2%甲酸的水溶液，B相洗脫溶劑為0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫條件為2% A相保持1.0min，1.0-6.0min A相比例升至17%，6.0-6.1minA相比例升至50%，6.1-8.0min，A相比例保持為50%，8.0-8.1min A相比例變?yōu)?%，8.1-9.0min A相比例保持為2%；流動(dòng)相流速為0.3mL/min；柱溫23 ℃；進(jìn)樣量5μL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的煙葉樣品粉末為新鮮煙葉樣品粉末，每100mg新鮮煙葉樣品粉末共加入1500μL提取劑，所述的新鮮煙葉樣品粉末的制備方法為：將新鮮的煙葉樣品在液氮冷凍下研磨粉碎至小于40目，磨好樣品迅速轉(zhuǎn)入離心管封存于-80℃冰箱，備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的煙葉樣品粉末為烤后煙葉樣品粉末，每10mg烤后煙葉樣品粉末共加入1500μL提取劑，所述的烤后煙葉樣品粉末的制備方法為：將烤后煙葉樣品研磨粉碎至小于40目，磨好樣品轉(zhuǎn)入離心管封存于4℃冰箱，備用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步驟1）中所述的甲醇-甲基叔丁基醚-水的體積比為37:45:68。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步驟1）中所述的超聲的時(shí)間為25~35min，離心的時(shí)間為3~7min，離心力≥5000g。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步驟1）中所述的內(nèi)標(biāo)溶液為50μg/mL的對(duì)羥基香豆酸的乙腈溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步驟1）中所述的內(nèi)標(biāo)溶液與下層清液的體積比為1:60。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步驟2）中所述的馬來(lái)酰肼及其糖苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為馬來(lái)酰肼、馬來(lái)酰肼-O-β-D-葡萄糖苷及馬來(lái)酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液或馬來(lái)酰肼及馬來(lái)酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的任一種。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的煙葉馬來(lái)酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步驟2）和3）中所述的質(zhì)譜分析條件：毛細(xì)管電壓，4500V；噴霧器壓力，2.0 bar；干燥器流速，8L/min；干燥溫度，200℃；質(zhì)量范圍100-1000m/z；采集頻率，1.5Hz；質(zhì)量軸校正溶液，甲酸鈉；質(zhì)量軸校正模式，內(nèi)標(biāo)校正；離子采集模式，正離子模式。