[發(fā)明專利]靶向wls基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711027633.1
• 申請(qǐng)日: 2017-10-27
• 公開（公告）號(hào): CN109722448A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣欣泉;杜佳慧;林淑賢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867
• 代理公司: 上海宣宜專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31288
• 代理人: 楊小雙

1.一種靶向wls基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

分別構(gòu)建V#wls-shRNA重組載體質(zhì)粒、病毒包裝輔助質(zhì)粒Helper 1.0和病毒包裝輔助質(zhì)粒Helper 2.0；

將所述V#wls-shRNA重組載體質(zhì)粒、病毒包裝輔助質(zhì)粒Helper 1.0和病毒包裝輔助質(zhì)粒Helper 2.0共同對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，得到所述靶向wls基因RNA干擾重組慢病毒載體。

2.如權(quán)利要求1所述的靶向wls基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建V#wls-shRNA重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建方法是在V#shRNA載體的多克隆位點(diǎn)中連接雙鏈DNA片段，元件順序?yàn)閁6-MCS-Ubiquitin-Cherry-IRES-puromycin，酶切位點(diǎn)為克隆位點(diǎn)：Age I、EcoR I。

3.如權(quán)利要求2所述的靶向wls基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的雙鏈DNA片段為以下序列：

Wls-RNAi寡核苷酸序列：

正義鏈的序列如SEQ ID NO.1所示：

CCGGTCCAAGGGAAATTGAAGCAAACTCGAGTTTGCTTCAATTTCCCTTGGATTTTTG，

正義鏈的序列如SEQ ID NO.2所示：

GATCCAAAAATCCAAGGGAAATTGAAGCAAACTCGAGTTTGCTTCAATTTCCCTTGGA。

4.如權(quán)利要求1所述的靶向wls基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述病毒包裝輔助質(zhì)粒Helper 1.0的構(gòu)建方法為：Helper 1.0載體質(zhì)粒總長10703bp，含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。

5.如權(quán)利要求1所述的靶向wls基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述病毒包裝輔助質(zhì)粒Helper 2.0的構(gòu)建方法為：Helper 2.0載體質(zhì)粒總長6503bp，含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。

6.如權(quán)利要求1所述的靶向wls基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染的操作方法為：接種細(xì)胞后，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)合適的MOI值＝50進(jìn)行目的病毒轉(zhuǎn)染，8-12小時(shí)后換回普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后利用熒光顯微鏡拍照觀察轉(zhuǎn)染效率，72h后提取RNA與蛋白檢測目的基因wls干擾效率。

7.一種如權(quán)利要求1所述的靶向wls基因RNA干擾重組慢病毒載體在研究骨組織生長發(fā)育過程中wnt配體來源方面的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：靶向干擾骨細(xì)胞系MLO-y4中wls基因表達(dá)，干擾wnt配體的分泌，礦化誘導(dǎo)4天、7天后分別行堿性磷酸酶染色與茜素紅染色檢測其礦化能力。