[發明專利]一種基于鉻的功能核酸的傳感器及其應用

有效

• 申請號: 201711027585.6
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107988323B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 羅云波;許文濤;黃昆侖;田晶晶;杜再慧;肖冰;董凱
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6825;C12N15/113;G01N21/78
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

1.一種基于鉻的功能核酸的傳感器，包括分子識別元件、信號放大元件和信號轉換元件，其特征在于，

所述分子識別元件包括鉻離子脫氧核酶；所述鉻離子脫氧核酶由底物鏈和酶鏈組成；

所述信號放大元件包括等溫擴增體系和氯高鐵血紅素，所述等溫擴增體系包括擴增模板；

所述脫氧核酶底物鏈的序列(5’-3’)為：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；

所述脫氧核酶酶鏈的序列(3’-5’)為：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；

所述擴增模板的序列(5’-3’)為：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；

所述信號轉換元件包括顯色劑；所述等溫擴增體系包括A體系和B體系；

所述A體系包括：擴增模板、dNTPs和鉻離子脫氧核酶切割產物；

所述B體系包括：Bst DNA聚合酶及其緩沖溶液、Nt.BstNBI切刻內切酶及其緩沖溶液；

所述信號轉換元件還包括終止劑。

2.根據權利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述終止劑為硫酸；所述顯色劑為TMB顯色劑。

3.一種非疾病診斷目的檢測鉻離子的方法，其特征在于，包括如下步驟：

制備鉻離子濃度和G-四鏈體功能核酸顯色光密度關系的標準曲線；

按上述制備標準曲線的過程測定待測樣品的G-四鏈體功能核酸顯色光密度值，通過上述標準曲線計算鉻離子的濃度；

其中，制備標準曲線的步驟包括：

(1)在鉻離子脫氧核酶的底物鏈和酶鏈中加入不同濃度鉻離子溶液，制備鉻離子脫氧核酶切割產物；

所述脫氧核酶底物鏈的序列(5’-3’)為：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；

所述脫氧核酶酶鏈的序列(3’-5’)為：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；

(2)將擴增模板，dNTPs，鉻離子脫氧核酶切割產物和超純水混合均勻，制備A體系；將Bst DNA聚合酶、聚合酶反應緩沖溶液，Nt.BstNBI切刻內切酶和切刻內切酶的反應緩沖溶液混合均勻，制備B體系；

所述擴增模板的序列(5’-3’)為：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；

(3)A體系先進行孵育，然后與B體系迅速進行混合，孵育擴增，終止反應后得到擴增產物；

(4)將擴增產物、酶活緩沖液和氯高鐵血紅素稀釋溶液混勻并反應，形成G-四鏈體結構；

(5)向步驟(4)混合液中加入顯色液，混勻并反應，反應結束后加入H₂SO₄，測定OD₄₅₀值，得到OD₄₅₀值隨鉻離子濃度變化的標準曲線。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)的操作為：將鉻離子脫氧核酶底物鏈和酶鏈用緩沖液稀釋，95℃加熱15min，然后緩慢降至25℃；加入待測鉻離子溶液，25℃孵育6min，加入終止液，得到鉻離子脫氧核酶切割產物。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)的操作為：A體系于55℃孵育5min，然后與B體系迅速進行混合，55℃孵育擴增20min，95℃保持10min以終止反應。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(4)中反應溫度為37℃，反應時間為30min；步驟(5)中反應溫度為37℃，反應時間為10min。