[發明專利]一種非小細胞肺癌miRNA檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201711027306.6
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107841560A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 李文德;陳思羽;黃韌;孫杰;吳科峰
• 申請（專利權）人: 廣東省實驗動物監測所
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司44100
• 代理人: 吳澤燊

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種用于檢測非小細胞肺癌的靶向診斷技術，特別是一種用于檢測非小細胞肺癌的miRNA檢測試劑盒及其應用。

背景技術

非小細胞肺癌是一種常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率高居各癌癥致死率之首。根據世界衛生組織報告，全球癌癥死亡人數到2030年將超過1310萬/年，全球每年死于非小細胞肺癌的患者達137萬以上。非小細胞肺癌起病隱匿，大多在晚期才能被發現，其5年生存率約在15％左右。若能做到早期診斷，其生存率將被大大提高。

現有的臨床診斷技術如X光、B超等無法做到在臨床早期發現，而CT、MRI和PET等檢查，可以發現更小的腫瘤組織，但其特異性低，仍需要病理活檢的輔助才能明確診斷。纖支鏡等內窺鏡的使用可提高了非小細胞肺癌的診斷率，但均為介入性檢查，對患者的損傷和痛苦大，且對操作者技術要求高，也并非肺內所有的部位都能取到活檢，不適用于大規模的人群篩選普查。液體活檢作為新型的檢測手段，具有特異性高、無創、快捷等優點，是癌癥檢查發展的趨勢與方向。

發明內容

本發明的一個目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種使用方便、快捷、特異性高、可作為非小細胞肺癌早期輔助診斷的miRNA檢測試劑盒。

為此，本發明提供了一種非小細胞肺癌miRNA檢測試劑盒，其包括miR-146和miR-340聯合使用作為非小細胞肺癌分子標記物。

此外，本發明還提供了一種非小細胞肺癌miRNA檢測試劑盒，其包括miR-146、miR-340和miR-U6，其中miR-U6作為內參。

此外，本發明還提供了一種非小細胞肺癌miRNA檢測試劑盒，其包括熒光定量PCR反應體系、內參體系和逆轉錄反應體系。

在本發明的一個方面，所述熒光定量PCR反應體系中包括分別針對miR-146、miR-340的正向引物和反向通用引物。其中，針對所述miR-146的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，針對所述miR-340的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID ID No.5所示。所述熒光定量PCR反應體系的試劑包括：SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和純水。

所述內參體系包括內參miR-U6和針對miR-U6的正向引物、針對miR-U6的反向引物：針對miR-U6的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：針對miR-U6的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述反轉錄反應體系的試劑包括多聚腺苷酸聚合酶、反轉錄酶混合液、反轉錄緩沖液和無核酸酶雙蒸水。

上述熒光定量PCR反應體系的總體積為20μL：所述熒光定量PCR反應體系中還包括DNA模板：其中，所述SYBR Green混合液的體積是10μL，所述正向引物液的體積是0.5μL，所述反向通用引物液的體積是0.5μL，所述DNA模板2μL，無核酸酶雙蒸水7μL：所述正向引物液的使用濃度為2μM，所述反向通用引物液的使用濃度為2μM：所述DNA模板是所述反轉錄反應體系反應后的產物稀釋10倍獲得的。

上述反轉錄反應體系的總體積為20μL：所述反轉錄反應體系中還包括miRNA樣品：其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的體積是0.25μL，所述反轉錄酶混合液的體積是5μL，所述反轉錄緩沖液的體積是4.0μL，所述miRNA樣品的加入量是1.0μg，其余是無核酸酶純水：所述多聚腺苷酸聚合酶的使用濃度為40U/μL：所述miRNA樣品中含有內參miR-U6。

在另一方面，本發明還提供了miR-146和miR340聯合使用用于制備診斷非小細胞肺癌的試劑。

判斷公式為：Y＝2.251×A_miR-340+1.706×B_miR-140-4.729

當Y>0.5時，可診斷為非小細胞肺癌。

本發明具有的積極效果：

(1)miR-146和miR-340作為組合的分子標記物，首次應用于上述miRNA非小細胞肺癌檢測試劑盒的開發，實現了其在早期診斷非小細胞肺癌中的應用。

(2)本發明的miRNA檢測試劑盒選擇了特異性強、靈敏度高的miR-146和miR-340的miRNA標記物進行組合，開發成檢測試劑盒，檢測快速方便、準確率高，可滿足臨床快速早期診斷非小細胞肺癌的需求。