[發明專利]一株殺菌固氮熒光假單胞菌及其發酵方法與應用

在審

• 申請號: 201711027268.4
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107557326A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 張友明;涂強;于芳楠;荊曉姝
• 申請（專利權）人: 山東大學;德州邁科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P1/00;A01P3/00;A01P7/04;A01P21/00;C12R1/39
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司11429
• 代理人: 張祥明

1.熒光假單胞菌(Pseudomonas protegens CHA0)突變菌株為CHA0-△retS-NiF，其保藏編號為：CGMCC No.14476。

2.熒光假單胞菌(Pseudomonas protegens CHA0)突變菌株CHA0-△retS-NiF的發酵培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)種子活化：從-80℃超低溫冷凍存儲箱中取出含有CHA0-△retS-NiF菌種的甘油管，待解凍后取少量菌液劃線于LB+genta 20平板上，于30℃恒溫生化培養箱中倒置培養20小時，從平板上隨機挑選5個單菌落進行菌落PCR驗證以確保獲得正確的目的菌株；

(2)搖瓶種子培養：將活化好的CHA0-△retS-NiF菌種接入KB培養基中，放置在全溫振蕩培養箱中培養20小時，得到種子液；

(3)發酵罐培養：將種子液接種到裝有KB培養基發酵罐中，接種量為5～10％，即每100mlKB培養基加入5～10ml種子液，接種完畢后進行通氣量，溶氧，溫度，轉速，pH設置，每隔6小時取菌液測定細胞密度，發酵周期為96小時。

3.根據權利要求2所述的發酵培養方法，其特征在于，步驟(2)與步驟(3)所述KB培養基的配方為：每1000mL水中含甘油10mL，蛋白胨20g，K₂HPO₄ 1.5g，MgSO₄·7H₂O 1.5g。

4.根據權利要求2所述的發酵培養方法，其特征在于，步驟(2)中培養條件為30℃，200rpm。

5.根據權利要求2所述的發酵培養方法，其特征在于，步驟(3)所述發酵罐培養條件為：溫度為26～32℃，pH為6～7.5，轉速為300～600rpm，通氣量為0.8～4.0L/min，溶氧0.8～1.0L/min，溶氧不與轉速串聯，培養12～24小時后流加25～100mL的質量分數為50％葡萄糖水溶液，此后每間隔2～6小時流加一次25～100mL的50％葡萄糖水溶液，直到發酵結束，期間用體積比為20％磷酸，氨水維持pH的穩定，體積比50％消泡劑進行消泡。

6.根據權利要求5所述的發酵培養方法，其特征在于，步驟(3)所述發酵培養條件為：溫度為28℃，pH為7，轉速為600rpm。

7.一種以熒光假單胞菌(Pseudomonas protegens CHA0)突變菌株CHA0-△retS-NiF為活性成分的微生物菌劑。

8.根據權利要求7所述的微生物菌劑，其特征在于，其制備方法為：步驟(3)所述發酵罐培養的菌體進入穩定期，細胞密度達到最大值時進行離心，冷凍干燥后收集菌體，即得。

9.權利要求1所述熒光假單胞菌突變菌株CHA0-△retS-NiF在殺菌固氮、促進植物生長方面的應用。