[發(fā)明專利]一種共軸三維受激輻射損耗超分辨顯微成像方法和裝置

有效

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• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107941763B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 匡翠方;劉少聰;劉文杰;陳友華;朱大釗;劉旭;李海峰;張克奇;毛磊
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發(fā)明公開一種共軸三維受激輻射損耗超分辨顯微成像方法，包括步驟：1)激發(fā)光和損耗光合束后，調(diào)制為線偏振光并調(diào)整線偏振方向；2)利用空間光調(diào)制器加載的0?2π渦旋位相板和0?π位相板同時對激發(fā)光和損耗光進(jìn)行兩次調(diào)制；損耗光一部分光調(diào)制成為橫向的空心光斑，另一部分調(diào)制成為軸向的空心光斑；3)將激發(fā)光偏振調(diào)成圓偏光且旋向和渦旋位相板的旋向相反，損耗光偏振態(tài)轉(zhuǎn)化為圓偏光且旋向與渦旋位相板的旋向相同；4)利用激發(fā)光和損耗光聚焦至樣品上，激發(fā)光為實心光斑，損耗光為空心光斑，并分別激發(fā)和損耗樣品發(fā)出的信號光；5)收集信號光，得到對應(yīng)到樣品掃描點的顯微圖像。本發(fā)明還公開一種共軸三維受激輻射損耗超分辨顯微成像裝置。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于光學(xué)超分辨顯微成像領(lǐng)域，特別涉及一種共軸三維受激輻射損耗超分辨顯微成像方法和裝置。

背景技術(shù)

超分辨熒光顯微成像技術(shù)在過去十幾年里已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，并被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)等研究領(lǐng)域。超分辨熒光顯微鏡常被用于獲取某個單獨樣品的高分辨率結(jié)構(gòu)，如單細(xì)胞、單個熒光顆粒等，同時也被用于觀察不同樣品之間的相對空間位置分布和相互作用過程。但與此同時，超分辨率熒光成像在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用中也面臨很多實驗挑戰(zhàn)，因為熒光標(biāo)記過程和成像光束可能會改變成像樣品的結(jié)構(gòu)。

作為第一種突破遠(yuǎn)場衍射極限的超分辨熒光顯微成像技術(shù)，受激輻射損耗(STED)顯微技術(shù)的發(fā)展最為迅速，它的實驗裝置都是基于激光掃描共聚焦顯微鏡，在原本的實心激發(fā)光束的基礎(chǔ)上只需再額外添加一束損耗光束。損耗光束在經(jīng)過一定的相位和偏振調(diào)制后會聚焦成一個空心光斑，這個空心光斑通過高光強(qiáng)對熒光分子的刺激逼迫周圍被空心光斑激發(fā)的熒光分子發(fā)生受激輻射而無法產(chǎn)生熒光，而由于中心區(qū)域并沒有收到損耗光斑的影響，熒光分子正常發(fā)生自發(fā)輻射產(chǎn)生熒光。由此可見，通過損耗光的損耗效應(yīng)，可以等效于產(chǎn)生一個橫向方向半徑遠(yuǎn)小于正常艾里斑大小的激發(fā)光斑，這樣就大大提高了其分辨能力。在這樣的物理機(jī)制下，STED技術(shù)的分辨率取決于損耗光斑邊緣的損耗效率，也就取決于損耗光束的強(qiáng)度，強(qiáng)度越強(qiáng)，STED技術(shù)的等效有效點擴(kuò)散函數(shù)(PSF)越小。有效PSF的半高全寬(FWHM)可以近似表示為：其中I是損耗光強(qiáng)度，Is是對應(yīng)于將熒光強(qiáng)度損耗掉一半時的損耗光閾值光強(qiáng)。

STED系統(tǒng)所具有的超高分辨能力是大家有目共睹的，但是STED系統(tǒng)在搭建方面的難度也是大家公認(rèn)的。STED技術(shù)需要兩路光，兩路光在聚焦后需要橫向軸向都盡可能完美重合才能有較好的分辨率，同時兩路光對光路中像差的校正也有著更高的要求。德國的Hell組提出了共路STED，通過設(shè)計一種特殊雙折射材料的波片來保證只對STED光進(jìn)行調(diào)制而不對激發(fā)光進(jìn)行調(diào)制，從而實現(xiàn)在共路的條件下同時生成亮斑和暗斑，但是這種方法只能實現(xiàn)橫向分辨率的提高，對軸向分辨率的提高并沒有太大作用，因此導(dǎo)致其橫向分辨率(～20-40nm)和軸向分辨率(～900nm)的相當(dāng)大的差異。當(dāng)對二維樣品進(jìn)行成像時，這不會產(chǎn)生影響。但是當(dāng)對沿著光軸延伸的三維生物樣品進(jìn)行成像時，由于過低的軸向分辨率，圖像質(zhì)量將受到嚴(yán)重影響。在提高軸向分辨率方面，已有報道通過結(jié)合4Pi技術(shù)和STED技術(shù)(isoSTED)實現(xiàn)了雙色3D超分辨成像，其三維分辨率最高可達(dá)到40-45nm。但是isoSTED中的4Pi成像系統(tǒng)比較復(fù)雜，光路調(diào)節(jié)要求非常高，需要使用到雙物鏡的相干疊加，因此在實用性上非常有限。也有報道在原本渦旋位相板產(chǎn)生橫向空心光斑之外，再通過0-pi相位板來產(chǎn)生軸向的空心光斑，從而實現(xiàn)軸向的損耗來提高STED的軸向分辨率，從而滿足三維超分辨成像。這種方法雖然比isoSTED系統(tǒng)簡單，但是其三維空心光斑的調(diào)節(jié)是在兩路光路實現(xiàn)的，更容易產(chǎn)生額外的像差，成像質(zhì)量變差，同時兩路損耗光也造成成像系統(tǒng)較為復(fù)雜，調(diào)節(jié)難度仍然相對較大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種基于雙振鏡的三維結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微成像裝置。本裝置結(jié)構(gòu)緊湊簡單，方便調(diào)節(jié)；實現(xiàn)了共軸3DSTED，系統(tǒng)簡單，像差小，成像質(zhì)量高；通過一個空間光調(diào)制器實現(xiàn)了三維空心光斑調(diào)節(jié)，節(jié)約成本；特別適用于對熒光樣品進(jìn)行三維超分辨成像。