[發明專利]一種大腹園蛛包裹絲蛋白全長基因及其制備方法

在審

• 申請號: 201711024721.6
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107699567A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 溫睿;孟清
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;C12N15/70
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所31233
• 代理人: 黃志達,魏峯

技術領域

本發明屬于蜘蛛絲蛋白基因領域，特別涉及一種大腹園蛛包裹絲蛋白全長基因及其制備方法。

背景技術

蜘蛛絲是蜘蛛產生的一種天然的蛋白絲纖維，是其賴以生存的命繩，數十億年的進化賦予了蜘蛛絲優異的機械強度和生物相容性，是一種優質、理想的天然生物材料，綜合性能遠超蠶絲以及目前最好的人造纖維材。其在高性能纖維、復合材料和生物醫學工程材料等領域有著巨大的應用價值。目前為止國內外蛛絲蛋白纖維的人工仿生進展緩慢，由于蛛絲蛋白種類多、分子量大、且重復度高等特點，蛛絲蛋白全長編碼基因的鑒定和克隆一直很難實現。1990年美國科學院院刊(PNAS)才刊登了第一條蜘蛛絲拖絲蛋白MaSp 1部分編碼基因序列，由于蛛絲蛋白編碼基因的特殊性，其克隆領域的進展一直極其緩慢，

不同的蛛絲纖維雖然機械性能差異較大，但從分子水平分析這些絲纖維的化學本質均為蛋白質。蛛絲蛋白結構較為典型，分為N端非重復區(NT，約130個氨基酸)、C端非重復區(CT，約110個氨基酸)以及中間重復區組成(Rp，占到整個蛋白序列的90％以上)，不同的蛛絲蛋白纖維性能則主要由重復區決定，NT和CT則主要參與蛛絲蛋白高濃度存儲和成絲過程中的調節作用。

不同的蜘蛛絲雖然性能及分子水平的結構組成差異較大，但是它們擁有許多共同的優良品質：外觀光滑、閃亮、耐紫外線性能強、密度非常低以及記憶性能好等，另外，蜘蛛絲還擁有良好的耐高溫和低溫特性，另外由于蜘蛛絲為蛋白質聚合纖維，可生物降解等，因此生物親和性好，不會對環境造成污染，符合可持續發展的戰略要求。蜘蛛絲的種種優良品質使其成為一種亟待開發的戰略資源。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種大腹園蛛包裹絲蛋白全長基因及其制備方法，該基因包含有完整的NT端，重復區以及完整的CT端，用于編碼大腹園蛛包裹絲蛋白；該絲纖維在力學性能以及生物相容性上都優于蠶絲以及人造纖維，而且對環境無污染，為在基因工程上大規模生產蛛蛋白奠定了基因基礎。

本發明的一種大腹園蛛包裹絲蛋白全長基因，所述基因全長大小為10,338bp，共編碼3445個氨基酸，具體序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白分子量為330.0kDa。

所述全長基因中NT端大小為489bp，編碼163個氨基酸，具體序列如SEQ ID NO.2所示。

重復區大小為9117bp，共編碼3039個氨基酸，具體序列如SEQ ID NO.3所示。

CT端大小為297bp，共編碼99個氨基酸，具體序列如SEQ ID NO.4所示。

本發明的一種大腹園蛛包裹絲蛋白全長基因的制備方法，包括如下步驟：

(1)根據現有的蜘蛛包裹絲的AcSp蛋白基因，在NT端簡并引物，在重復區設計2條特異性引物，通過簡并PCR擴增得到部分的NT端基因序列；

(2)根據步驟(1)所獲得的序列分別設計2對特異性引物及1條錨定引物，通過錨定PCR將NT端補齊；

(3)根據步驟(2)所獲得的包含完整NT端序列，在NT端5’末端設計1條正向引物，在CT端3’末端設計1條反向引物，用于擴增全長AcSp基因；

(4)對步驟(3)所得PCR產物進行瓊脂糖凝膠切膠回收后，與載體pEASY-Blunt Zero Cloning Vector進行平末端連接反應，之后進行連接產物回收；

(5)對步驟(4)的連接產物進行平末端克隆，使用熱擊的轉化方法，轉入DH5α感受態細胞中進行轉化，將轉化后的菌液涂布在具有Amp和Kan的雙抗性的LB固體培養基上，過夜培養后，挑取單克隆進行PCR檢測；

(6)將步驟(5)中得到的陽性單克隆的質粒進行完整測序，最終得到大腹園蛛包裹絲蛋白全長基因。

所述步驟(1)中用于擴增部分NT端的正向引物：TGTTTYCARGCNGTNATG；

反向引物：GCACCACTGGTCTGAGAGAAC。

用簡并PCR獲得的部分NT端序列的正向引物為簡并引物，反向引物為重復區的特異性引物。

所述步驟(1)中的簡并PCR的條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環30次。

所述步驟(2)中的用于補全NT端的特異性引物1：GACTTGTTGCTTGAAACGATGCTG；用于補全NT端的特異性引物2：GCAGAGAAAGCTCCTTGGTCTTG；

錨定引物：ACTCCTGTGGAACCATCGGACGGGGGG。