[發(fā)明專利]一種草魚呼腸孤病毒類纖突VP56蛋白亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711023099.7
• 申請(qǐng)日: 2017-10-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107823640B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 裴超;高巖;孔祥會(huì);孫效迎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K39/15
• 分類號(hào): A61K39/15;A61P31/14;C12N15/70;C12N15/46;C12P21/02
• 代理公司: 新鄉(xiāng)市平原智匯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 41139
• 代理人: 路寬

1.一種草魚呼腸孤病毒類纖突VP56蛋白亞單位疫苗，其特征在于：所述亞單位疫苗蛋白由草魚呼腸孤病毒S7基因節(jié)段編碼，該草魚呼腸孤病毒S7基因節(jié)段的堿基序列如序列表SEQ ID No.1所示，其編碼的蛋白即為草魚呼腸孤病毒類纖突VP56蛋白亞單位疫苗蛋白，該亞單位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；

將該亞單位疫苗按照2μg疫苗蛋白/g魚體重量注射草魚腹腔后，通過(guò)激發(fā)草魚免疫細(xì)胞的增殖提高草魚抗草魚呼腸孤病毒感染的能力，草魚免疫細(xì)胞為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；

將該亞單位疫苗按照2μg疫苗蛋白/g魚體重量注射草魚腹腔后，通過(guò)誘導(dǎo)草魚抗病毒基因的表達(dá)有效提高草魚抗草魚呼腸孤病毒感染的能力，草魚抗病毒基因?yàn)镮gM、IFN I、MHC I和TLR22；

將該亞單位疫苗按照2mg疫苗蛋白/g魚體重量注射草魚腹腔后，通過(guò)誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生特異性抗體有效提高草魚抗草魚呼腸孤病毒感染的能力，進(jìn)而用于預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖中因草魚呼腸孤病毒感染而引起的草魚出血病。

2.一種權(quán)利要求1所述的草魚呼腸孤病毒類纖突VP56蛋白亞單位疫苗的制備方法，其特征在于具體步驟為：

（1）質(zhì)粒pET32a-VP56的構(gòu)建，以分離的草魚呼腸孤病毒的基因組為模板，反轉(zhuǎn)錄后用引物S7F1/S7R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后用Kpn I和Xho I雙酶切，回收1kb片段，同時(shí)將質(zhì)粒pET32a(+)用Kpn I和Xho I雙酶切，回收5.8kb片段，將上述回收的兩個(gè)DNA片段用T₄ DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）后在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選含有質(zhì)粒pET32a-VP56的陽(yáng)性重組菌；

（2）疫苗蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化：將含有質(zhì)粒pET32a-VP56的陽(yáng)性重組菌在含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按體積比1:100將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的含氨芐LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6，加入終濃度為1mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，離心收集菌體并用結(jié)合緩沖液懸浮，超聲波破碎1小時(shí)，離心收集沉淀并溶解在含6M尿素的結(jié)合緩沖液中，冰上過(guò)夜，將溶解上清用Ni-IDA瓊脂糖凝膠柱收集回收并透析復(fù)性即可獲得由序列表SEQ IDNo.1所示堿基序列編碼的亞單位疫苗蛋白。