[發明專利]一種草魚呼腸孤病毒VP35蛋白亞單位疫苗及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711022026.6
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN108324936B
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發明（設計）人: 孔祥會;高巖;裴超;孫效迎
• 申請（專利權）人: 河南師范大學
• 主分類號: A61K39/15
• 分類號: A61K39/15;A61P31/14
• 代理公司: 新鄉市平原智匯知識產權代理事務所(普通合伙) 41139
• 代理人: 路寬

1.一種草魚呼腸孤病毒VP35蛋白亞單位疫苗，其特征在于：所述亞單位疫苗蛋白的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示，該VP35蛋白亞單位疫苗免疫草魚魚體后，通過刺激魚體免疫細胞增殖、誘導魚體抗病毒基因上調表達以及刺激魚體特異性抗體產生以提高草魚抗草魚呼腸孤病毒感染的能力，進而用于預防水產養殖中因草魚呼腸孤病毒引起的草魚出血病，其中魚體免疫細胞為單核細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞，所述魚體抗病毒基因為IFNI、MHC I、IgM和TLR22。

2.一種權利要求1所述的草魚呼腸孤病毒VP35蛋白亞單位疫苗，其特征在于：所述亞單位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

3.一種權利要求1或2所述的草魚呼腸孤病毒VP35蛋白亞單位疫苗的制備方法，其特征在于具體步驟為：

（1）質粒VP35-pET32a的構建：以草魚呼腸孤病毒的雙鏈RNA基因為模板，通過反轉錄獲得cDNA，用引物F1和R1進行PCR擴增，產物純化后用Kpn I和Hind III雙酶切，回收1kp片段，同時將質粒pET32a(+)用Kpn I和Hind III雙酶切，回收5.8kb片段，將上述回收的兩個DNA片段用T₄ DNA連接酶連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌BL21（DE3）后在含氨芐青霉素的LB固體培養基培養，篩選含有VP35-pET32a的陽性菌液，所述引物F1為：5’-TCGGGTACCATGGAACCAGCAAAACC-3’，引物R1為：5’-ATAAGCTTGGT ACTGTCCC TGGATCTCAGG-3’；

（2）疫苗蛋白的誘導表達和純化：將含有VP35-pET32a的陽性菌液在含氨芐的LB液體培養基上于37℃培養過夜活化，按體積比1:100將培養液轉接到新鮮的含氨芐LB液體培養基上，于37℃培養至OD₆₀₀為0.6，加入終濃度1mM IPTG，繼續培養6小時，離心收集菌體并用結合緩沖液懸浮，超聲波破碎1小時，離心收集沉淀，并溶解在含6M脲的結合緩沖液中，冰上過夜，將溶解上清用Ni-IDA瓊脂糖凝膠柱收集回收并透析，最終得到由序列表SEQ ID No.1的基因序列編碼的亞單位疫苗蛋白。