[發明專利]用于檢測高血壓患者葉酸代謝相關基因多態性的引物對及試劑盒

在審

• 申請號: 201711015233.9
• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN107586837A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 滕祥云;黃少亞
• 申請（專利權）人: 長沙三濟生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及體外核酸檢測技術領域，尤其涉及一種用于檢測高血壓患者葉酸代謝相關基因多態性的引物對及試劑盒。

背景技術

葉酸是由喋呤啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸等組成的化合物，是一種水溶性B族維生素。它存在于許多植物和動物組織中，人體不能合成，必須從外界攝取。

葉酸是DNA及RNA合成中起重要作用酶的輔助因子，為核苷酸從頭合成提供一碳單位，在氨基酸的甲基化循環中參與甲基轉運，它在機體內的活性單位是5-甲基四氫葉酸。另一方面，葉酸作為同型半胱氨酸(Hcy)代謝中最重要的輔酶，其缺乏會導致Hcy下游代謝障礙，進一步導致其在血液中堆積，表現出血清中Hcy濃度高，引起機體出現多系統損傷。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)位于第一號染色體1ρ36.3位置，是參與體內葉酸代謝的關鍵酶，與體內葉酸/同型半胱氨酸(HCY)的代謝和蛋氨酸的合成有關，催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉換成5-甲基四氫葉酸鹽，使之能為同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸，并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一個較低的水平。該基因最常見的兩個單核苷酸多態性667C>T和1298A>C在中國人群中發生的概率分別為45.2％和18.6％。研究發現，MTHFR 677C>T突變可造成其編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，引起耐熱性和酶活性的下降，雜合MTHFR 677CT酶活性下降30％，純合667TT下降65％以上，在低葉酸環境下，純合667TT可顯著升高血漿同型半胱氨酸的濃度；MTHFR 1298A>C突變引起編碼的氨基酸由谷氨酸轉變為丙氨酸，也會導致酶活性下降，但是下降的程度比667T突變輕微，且位點A1298C與位點C667T突變有協同效應。兩種情況均阻礙了葉酸代謝，引起一系列疾病發病風險增加，而合理補充葉酸可以很大程度的防止基因缺陷引發的不良后果。

甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)也是參與體內葉酸代謝和同型半胱氨酸代謝的關鍵酶，其編碼基因位于5ρ15.3-ρ15.2。A66G位點是MTRR上的主要突變，MTHFR 66A>G突變可造成其編碼的氨基酸由異亮氨酸變成甲硫氨酸，突變導致其酶活性與同型半胱氨酸再甲基化速率降低，引起高同型半胱氨酸血癥。該位點在中國人群中該多態的頻率分布為：A占76％，G占24％左右。

MTHFR(C667T)、MTHFR(A1298C)和MTRR(A66G)位點的基因發生突變，均會導致代謝途徑中酶活性降低，從而影響人體內葉酸代謝的效率，使血液中同型半胱氨酸的濃度升高。《中國高血壓防治指南》中已明確指出，高同型半胱氨酸是我國高血壓患者最常見的危險因素，并與腦卒中呈顯著正相關，可使腦卒中的風險增加。

焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序(確定DNA中核苷酸的順序)方法，是新一代DNA序列分析技術。它是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。通過分析岀峰情況，達到測定DNA序列的目的。

醫院用于基因分型檢測的“金標準”是PCR-直接測序法，但直接測序法的敏感性不高，只能檢測出突變細胞比率在10-20％以上的腫瘤組織，對于含<10％突變細胞的腫瘤組織以及外周血，常規PCR-直接測序法幾乎無能為力。相比于直接測序法，焦磷酸測序的靈敏性更高、成本更低。