[發(fā)明專(zhuān)利]抑制人SRSF3基因表達(dá)的反義寡核苷酸序列及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711014985.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107828787B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭繼華;賈榮
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;A61K48/00;A61K31/7088;A61P35/00
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發(fā)明提供了一種抑制人SRSF3基因表達(dá)的反義寡核苷酸序列及其應(yīng)用。該反義寡核苷酸序列的分子式為：5’?GTTTCAACAAGCTAGAAATG?3’，每個(gè)反義寡核苷酸的堿基都做了2'?O?Methyl和硫代修飾。本發(fā)明的反義寡核苷酸抑制SRSF3基因外顯子4的外顯子剪切抑制子的功能，促進(jìn)了可變外顯子4的剪切，進(jìn)而減少了全長(zhǎng)有功能的SRSF3蛋白的表達(dá)，抑制了口腔癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有抑制口腔癌的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體涉及針對(duì)癌基因SRSF3的反義寡核苷酸序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人的基因序列包括外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)。由RNA聚合酶根據(jù)基因模板合成前體信使RNA(mRNA)包括外顯子和內(nèi)含子。內(nèi)含子必須由剪切復(fù)合體(spliceosome)去除并將外顯子連接，才能形成成熟的mRNA，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。前體mRNA中內(nèi)含子和外顯子的剪切并不是一成不變的，可以有多種剪切方式被稱(chēng)為可變剪切(alternativesplicing)。比如：有些外顯子可能在剪切時(shí)被排除在成熟的mRNA中，稱(chēng)為外顯子跳躍(exonskipping)，有些內(nèi)含子被保留在成熟的mRNA中，稱(chēng)為內(nèi)含子保留(intron retention)。因此，通過(guò)可變剪切的方式，一個(gè)基因往往可以產(chǎn)生多種mRNA，并編碼多種蛋白質(zhì)。目前發(fā)現(xiàn)超過(guò)90％的人類(lèi)基因的前體mRNA都會(huì)發(fā)生可變剪切，產(chǎn)生多種mRNA，極大地豐富了基因組的編碼能力。

很多研究都發(fā)現(xiàn)可變剪切與癌癥的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。癌細(xì)胞的前體mRNA的可變剪切方式與正常細(xì)胞有顯著區(qū)別¹。細(xì)胞中前體mRNA可變剪切的調(diào)節(jié)主要是可變剪切因子(splicing factor)。SRSF3(又稱(chēng)為SRp20)是一個(gè)重要的可變剪切調(diào)節(jié)因子。我們?cè)?010年發(fā)現(xiàn)SRSF3是一個(gè)原癌基因²。很多癌組織中都高表達(dá)SRSF3；抑制SRSF3的表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯影響，在裸鼠體內(nèi)成瘤能力也明顯下降；在非癌細(xì)胞中提高SRSF3的表達(dá)水平可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和在裸鼠體內(nèi)成瘤。抑制SRSF3的表達(dá)可以作為治療癌癥的一種方法。我們?cè)?015年發(fā)現(xiàn)人的SRSF3基因有一個(gè)可變外顯子4。不包含該外顯子的mRNA可以編碼全長(zhǎng)的有功能的SRSF3蛋白。而包含該外顯子的mRNA，由于出現(xiàn)了終止密碼子，只能編碼截短的SRSF3蛋白或經(jīng)NMD(nonsense-mediated decay)途徑降低。因此在癌細(xì)胞中包含外顯子4的mRNA很少，主要是不包括外顯子4的mRNA，有利于全長(zhǎng)有功能的SRSF3蛋白的表達(dá)。在外顯子4的3’端有一個(gè)外顯子剪切抑制子，能與PTPB1和PTBP2蛋白相互作用，促進(jìn)了可變外顯子4的跳過(guò)丟失，進(jìn)而增加了全長(zhǎng)有功能的SRSF3蛋白的表達(dá)，有利于癌癥的發(fā)生和發(fā)展³。因此，建立抑制細(xì)胞中前體mRNA的SRSF3基因中外顯子4在剪切中的跳躍丟失是亟待解決的問(wèn)題。

反義藥物又稱(chēng)反義寡核苷酸藥物，是指作為藥物使用的，長(zhǎng)度為10-30個(gè)堿基的人工合成DNA分子及其類(lèi)似物。根據(jù)核苷酸雜交原理，反義藥物能與特定基因的mRNA雜交，在轉(zhuǎn)錄水平上干擾致病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程。蛋白質(zhì)在人體代謝過(guò)程中扮演重要角色，大多數(shù)疾病都是由于蛋白質(zhì)異常引起的，無(wú)論腫瘤、心血管疾病或傳染性疾病，傳統(tǒng)藥物主要直接作用于致病蛋白質(zhì)本身，而反義藥物則作用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的mRNA，因此可廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療，比傳統(tǒng)藥物更具選擇性，而且具有高效低毒、用量少等特點(diǎn)。數(shù)年前，由于反義藥物合成價(jià)格昂貴，使該類(lèi)藥物難以進(jìn)行廣泛的臨床試驗(yàn)。近年來(lái)，由于合成技術(shù)的改進(jìn)和合成儀器的研制成功，反義藥物的成本已大為降低，從而加速了反義藥物的研究與開(kāi)發(fā)。

從藥動(dòng)學(xué)角度而言，由于體內(nèi)各器官組織存在核酸酶，因此天然的寡核苷酸進(jìn)入體內(nèi)極易被分解失活，故反義藥物多以修飾寡核苷酸為主，以增強(qiáng)其抗核酸酶降解的作用。