[發(fā)明專利]CsPR3基因及其在黃瓜抗枯萎病中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711014309.6
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN109706154B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉興旺;任華中;愛茲亞·斯蒂芬·巴斯婁牟;陳淑英;張亞琦;張文博;李雨菁;湯敏;翟徐玲
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/113;C12N15/82;C07K14/415
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發(fā)明涉及CsPR3基因及其在黃瓜抗枯萎病中的應(yīng)用。本發(fā)明基于BSR?seq法篩選到黃瓜抗枯萎病基因CsPR3，CsPR3基因啟動子的核苷酸序列見SEQ ID NO:3。實(shí)驗(yàn)證明CsPR3在根部強(qiáng)優(yōu)勢表達(dá)，并且受枯萎病菌的誘導(dǎo)。菌株侵染CsRP3表達(dá)顯著不同的黃瓜品系，CsPR3表達(dá)量高的品系抗枯萎病能力高，相反CsPR3表達(dá)量低的品系較易感染枯萎病。通過克隆抗枯萎病能力不同品系(3461和3229)的CsPR3基因，發(fā)現(xiàn)基因編碼蛋白未發(fā)生改變。基因啟動子區(qū)與HD?ZIP III類型轉(zhuǎn)錄因子(CsHB15)的結(jié)合位點(diǎn)處發(fā)生突變。該基因的克隆及表達(dá)分析對黃瓜抗枯萎病基因資源的篩選提供了有力的技術(shù)支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及CsPR3基因及其在黃瓜抗枯萎病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

黃瓜(cucumis sativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)黃瓜屬(cucumis)一年蔓生的草本植物。黃瓜具有產(chǎn)量高、效益好等特點(diǎn)，是世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一，占全國蔬菜面積的10％左右。同時(shí)，黃瓜也特別容易遭受病害的侵染，其中黃瓜枯萎病(Fusarium wilt)是系統(tǒng)性侵染的土傳病害。黃瓜枯萎病，生產(chǎn)上又稱之為死秧病、蔓割病、萎蔫病，在我國各地均有發(fā)生。黃瓜枯萎病的病原菌是尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen)，有4個(gè)生理小種，生理小種4號是我國普遍流行的黃瓜枯萎病致病菌。病原菌從根部傷口到根毛生長點(diǎn)侵染植株，進(jìn)而破壞黃瓜根、莖和葉的維管束，使黃瓜植株吸收和運(yùn)輸水分功能喪失，最終造成黃瓜植株枯萎死亡。枯萎病一般可造成黃瓜產(chǎn)量下降10％-30％，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80％-90％甚至絕產(chǎn)，是黃瓜病害中最為嚴(yán)重、造成經(jīng)濟(jì)損失最大的病害之一。由于黃瓜生產(chǎn)面積的逐年擴(kuò)大由此帶來的連作重茬導(dǎo)致黃瓜枯萎病日益加重。生產(chǎn)上采用化學(xué)防治對抗枯萎病效果不理想，不僅使生產(chǎn)投入增加且會造成環(huán)境的污染，主要靠采用的嫁接栽培措施能有效防治。但容易降低黃瓜品質(zhì)，選育抗黃瓜枯萎病品種是有效控制黃瓜枯萎病最安全、最經(jīng)濟(jì)的途徑。因此，鑒定和篩選抗枯萎病的基因，將有利于高效改良黃瓜的枯萎病抗性，為黃瓜抗病分子育種提供技術(shù)支撐。

克隆基因是尋找與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記最重要的應(yīng)用之一，與經(jīng)典的圖位克隆相比，混合分析(BSA，Bulked Sergeant Analysis)結(jié)合RNA-SEQ是一種快速高效定位基因的新方法，克服了基因組一段區(qū)域內(nèi)分子標(biāo)記較少的瓶頸，根據(jù)RNA-SEQ的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，同時(shí)分析差異表達(dá)基因所參與的代謝調(diào)控途徑(Liu et al.,2012)。分析群體中選擇具有相對性狀的單株混成2個(gè)bulk池，對2個(gè)池分別混合提取RNA進(jìn)行測序，測序完成后可以獲得大量的SNP，這些SNP可以作為分子標(biāo)記檢測突變池與正常池中的基因型頻率。在突變池中，當(dāng)逼近候選基因位點(diǎn)時(shí)，來自于野生型的SNP基因型頻率會越來越低；反之，在正常池中，當(dāng)逼近候選基因位點(diǎn)時(shí)，來自野生型的SNP基因頻率就會越來越高。通過檢測SNP與目的基因的連鎖程度，來確定與目標(biāo)性狀連鎖的目標(biāo)基因所在的染色體區(qū)域。這種方法在基因定位中具有良好的應(yīng)用前景。目前利用這種方法已經(jīng)分離了大量的重要基因，尤其是鲇魚的抗病基因和小麥的的Yr15基因(wang et al.,2013；Ricardo et al.,2014)。這種方法對已有基因組的物種特別適用，可以利用兩親本與參考基因組中存在差異的SNP，結(jié)合遺傳分離群體及自然群體分析，可迅速找到與目標(biāo)性狀基因連鎖的基因，大大縮短了傳統(tǒng)方法獲得基因的時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種具有特定啟動子序列的CsPR3基因。

本發(fā)明的另一目的是提供所述CsPR3基因在黃瓜抗枯萎病中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一個(gè)全新的與應(yīng)答枯萎病菌侵染相關(guān)的關(guān)鍵基因CsPR3，該基因通過BSR-seq方法獲得。所述CsPR3基因編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述CsPR3基因的啟動子的核苷酸序列為：

i)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或