[發明專利]單分子條件下檢測前列腺特異抗原的方法

有效

• 申請號: 201711013561.5
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN107884373B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 何丹農;徐艷;王萍;金彩虹
• 申請（專利權）人: 上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28
• 代理公司: 上海東亞專利商標代理有限公司 31208
• 代理人: 董梅

1.一種單分子條件下檢測前列腺特異抗原的方法，其特征在于：利用DNA四面體構建三維的檢測基底，在其上連接的核酸適配體aptamer，識別并捕獲PSA；引入連接aptamer的量子點，實現檢測信號的測定，包括下述步驟：

（1）DNA四面體與aptamer組裝：將DNA 1-5混合均勻，于高鹽濃度緩沖液中高溫退火形成載帶有aptamer的DNA四面體，也稱DNA四面體與aptamer組裝體；

（2）量子點與aptamer組裝：將量子點與生物素修飾的aptamer DNA 6在1×PBS緩沖溶液中混合均勻，于室溫孵育；隨后混合液離心洗去過量DNA，沉淀物采用PBS緩沖溶液重旋，4℃保存；

（3）載帶有aptamer的DNA四面體在玻片上的固定：將DNA四面體與aptamer組裝體稀釋后，與鏈霉親和素修飾的玻片孵育，孵育濃度為10^-10 ~10^-9孵育一定時間后，緩沖液沖洗干凈過量組裝體；

（4）檢測：制備樣品池，在樣品池中滴加100 μL含有PSA的反應溶液，孵育一定時間后，洗去過量PSA；加入一定濃度的連接有aptamer的量子點，孵育一定時間后，洗去過量的量子點；首先激光激發四面體所帶熒光，隨后更換激光通路，激發量子點熒光，通過二者共定位確定信號采集位點。

2.根據權利要求1所述的單分子條件下檢測前列腺特異抗原的方法，其特征在于，所采用的DNA四面體為不同大小的DNA折紙，邊長為18.7 nm。

3.根據權利要求1或2所述的單分子條件下檢測前列腺特異抗原的方法，其特征在于，量子點修飾DNA時的緩沖溶為pH=7.4、8 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄、136 mM Na Cl、2.6 mM KCl、1×PBS緩沖液；DNA四面體合成與鏈霉親和素修飾的玻片孵育時的緩沖液為pH=8.0、40mM Tris-乙酸、1 mM EDTA、12.5 mM MgCl₂的 1×TAE-Mg²⁺溶液，檢測時緩沖液為pH=7.4、100 mM KCl、0.4% w/v葡萄糖、1 mg/mL葡萄糖氧化酶、0.04 mg/mL過氧化氫酶、10 mM 磷酸鹽緩沖液溶液。

4.根據權利要求1所述的單分子條件下檢測前列腺特異抗原的方法，其特征在于所采用的aptamer為針對PSA的aptamer，為2012年4月8日發表在Biosensors andBioelectronics第36期第1卷第35-40頁題為An aptamer based resonance lightscattering assays of prostate specific antigen的論文中第2頁2.1 Materials andregents中所記載的序列。

5.根據權利要求1或2所述的單分子條件下檢測前列腺特異抗原的方法，其特征在于所采用的DNA四面體與aptamer合成時，DNA 1-5混合比例為1:1:1:1:1；

所采用的DNA四面體與aptamer合成時的退火方式為采用PCR退火，設置程序為95℃反應5 min，4℃保持15 min。

6.根據權利要求1所述的單分子條件下檢測前列腺特異抗原的方法，其特征在于采用鏈霉親和素修飾的量子點與生物素修飾的DNA 6連接時的量子點濃度為100 nM，量子點與DNA 6連接的比例為1:20，量子點與DNA 6的孵育時間為1 hr。