[發明專利]一種以活性形式表達的谷氨酰胺轉氨酶的突變體

有效

• 申請號: 201711012420.1
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN107574159B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 劉松;任蕊蕊;李江華;陳堅;堵國成;石誠
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N1/19;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種谷氨酰胺轉氨酶突變體，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.編碼權利要求1所述突變體的核苷酸序列。

3.表達權利要求1所述突變體的重組菌。

4.根據權利要求3所述的重組菌，其特征在于，以解脂耶氏酵母po1h為宿主。

5.根據權利要求3所述的重組菌，其特征在于，構建方法是：將茂源鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉氨酶基因和吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉氨酶酶原區hpro基因融合后與載體連接，將重組質粒線性化后轉到宿主菌中，所述茂源鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，所述吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉氨酶酶原區hpro的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

6.根據權利要求3所述的重組菌，其特征在于，構建方法是：

(1)將茂源鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉氨酶基因和吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉氨酶酶原區hpro基因融合后與載體連接，構建質粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，所述吸水鏈霉菌來源的谷氨酰胺轉氨酶酶原區hpro的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)重組質粒pINA1297/hpro-mTG線性化后，轉化到解脂耶氏酵母po1h，經營養缺陷型培養基YNB篩選后，獲得重組菌po1h/hpro-mTG。

7.一種表達活性谷氨酰胺轉氨酶的重組菌，其特征在于，所述重組菌共同表達蛋白酶TAMEP和谷氨酰胺轉氨酶hpro-mTG，所述蛋白酶TAMEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述谷氨酰胺轉氨酶hpro-mTG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.根據權利要求7所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌的構建方法：首先構建蛋白酶TAMEP的表達載體pINA1297/HT，將質粒線性化后轉化到重組菌po1h/hpro-mTG中，經營養缺陷型培養基YNB篩選后，得到表達活性谷氨酰胺轉氨酶的重組菌po1h/HM+HT。

9.應用權利要求3-8任一所述重組菌發酵生產谷氨酰胺轉氨酶突變體的方法，其特征在于，所述方法為：

(1)搖瓶發酵：將重組菌接種于YPD液體培養基中，25-30℃，180-230rpm培養20-27h，按8-12％的接種量轉接于解脂耶氏酵母發酵培養基中，25-30℃，180-230rpm搖瓶培養4-6d；

(2)發酵罐發酵：將重組菌接種于YPD液體培養基中，28℃，200rpm培養24h后，種子液以10％的接種量接種至發酵罐中，控制溫度28℃，攪拌轉速為600rpm，通氣量為2vvm，當溶氧開始反彈且60％時，開始流加50％(W/V)甘油120mL，調節轉速使溶氧30％，發酵120h。

10.根據權利要求9所述方法得到的谷氨酰胺轉氨酶在醫藥、化妝品生產以及皮革加工方面的應用。