[發明專利]集成納米光學諧振腔的三維等離共振傳感器用于癌癥蛋白標志物液體活檢的應用

在審

• 申請號: 201711012212.1
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN107807111A
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發明（設計）人: 劉鋼;許浩
• 申請（專利權）人: 量準（上海）實業有限公司
• 主分類號: G01N21/59
• 分類號: G01N21/59
• 代理公司: 北京金蓄專利代理有限公司11544
• 代理人: 馬賀

技術領域

本發明涉及傳感技術領域，特別地，涉及一種集成納米光學諧振腔的三維等離共振傳感器用于癌癥蛋白標志物液體活檢的應用。

背景技術

癌胚抗原(CEA)是1965年Gold和Freedman首先從胎兒及結腸癌組織中發現的。CEA是一種分子量為22KD的多糖蛋白復合物，45％為蛋白質。CEA的編碼基因位于19號染色體。一般情況下，CEA是由胎兒胃腸道上皮組織、胰和肝細胞所合成。通常在妊娠前6個月內CEA含量增高，出生后血清中含量已很低。 96％-97％非吸煙健康成年人血清中CEA濃度小于2.5μg/L，大量吸煙者有 20％-40％的人CEA>2.5μg/L，少數CEA>5.0μg/L。

CEA屬于非器官特異性腫瘤相關抗原，分泌CEA的腫瘤大多位于空腔臟器，如胃腸道、呼吸道、泌尿道等。正常情況下CEA經胃腸道代謝，而腫瘤狀態時的CEA則進入血和淋巴循環，引起血清CEA異常增高，使上述各種腫瘤患者的血清CEA均有增高。在臨床上，當CEA大于60μg/L時，可見于結腸癌、直腸癌、胃癌和肺癌。CEA值升高，表明有病變殘存或進展。如肺癌、乳腺癌、膀胱癌和卵巢癌患者血清CEA量會明顯升高，大多顯示為腫瘤浸潤，其中約70％為轉移性癌。一般來說，手術切除后6周，CEA水平恢復正常，否則提示有殘存腫瘤，若CEA濃度持續不斷升高，或其數值超過正常5-6倍者均提示預后不良。連續隨訪定量檢測血清CEA含量，對腫瘤病情判斷更具有意義。

癌胚抗原是一個廣譜性腫瘤標志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發展、監測和預后估計是一個較好的腫瘤標志物。97％的健康成人血清CEA濃度在2.5g/L以下，原發性結腸癌患者CEA增高占45～80％。除原發性結腸癌以外，胰腺癌、膽管癌、胃癌、食管癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系統的腫瘤陽性率也很高，一般在50～70％。因此該指標檢測對于診斷某些疾病具有較大意義。

傳統的測定CEA的方法有熒光免疫分析、放射免疫法，酶聯免疫檢測法等。這些檢測方法雖然在一定程度上靈敏有效，但對技術要求高，耗時耗力，且對儀器有一定的要求，各自具有一定的局限性。

目前，檢測低濃度生物分子，如腫瘤標志物的免標記感應器，在藥物開發研究和現場即時診斷等應用中備受矚目。光學器件如光子晶體，環形諧振器，干涉儀和表面等離子體共振(SPR)傳感器，由于其靈敏檢測，是有希望代替傳統酶聯免疫吸附測定技術(ELISA)的方法。但是，有著精準定位的笨重的外部光學裝置仍然是需要的—這限制了應用的普及。另外，基于超強光透射(EOT) 的等離子體傳感器可以使用非相干光源激發表面等離子體，用便攜式光譜儀實現檢測；但是，這些器件的靈敏性要比傳統的SPR傳感器低一個數量級。

發明內容

本發明提供了一種集成納米光學諧振腔的三維等離共振傳感器用于癌癥蛋白標志物液體活檢的應用，解決了現有技術檢測方法靈敏度有限，操作技術及使用儀器上存在很大局限性的問題。

為實現上述目的，本發明提出了一種集成納米光學諧振腔的三維等離共振傳感器用于癌癥蛋白標志物液體活檢的應用，包括如下步驟：

(1)將三維等離共振傳感器浸入到2～20mM的巰基十一酸(MUA)溶液中，室溫下培養12～36小時，傳感器表面形成自組裝單層膜；

(2)將濃度為1～100μg/ml的CEA抗體通過碳化二亞胺(EDC)與N-羥基琥珀酰亞胺耦合(NHS)，并與巰基十一酸(MUA)共價結合；

(3)將步驟(1)處理后的無變頻三維陣列等離子共振傳感器在BAS封閉液中培養，之后在乙醇胺溶液中培養；

(4)將步驟(3)培養后的無變頻三維陣列等離子共振傳感器置于含有A 待測樣本的磷酸鹽緩沖液(PBS)中培養；

(5)進行光譜測量，在水中測量透射峰。

優選的，所述步驟(2)是在室溫條件下進行，步驟(1)處理后的傳感器用70％的乙醇清洗，清洗后在N₂中干燥，干燥后在400mM碳化二亞胺(EDC)與 100mM N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)按1:1混合的混合物中培養30～120分鐘，之后將傳感器在磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗，沖洗后立即用1～100μg/ml的單克隆抗CEA抗體培養1～5小時。

優選的，所述步驟(3)是在室溫條件下進行，在10μg/mL的BSA封閉液中培養，之后在10％的乙醇胺溶液中培養30～60分鐘來封上未反應的N-羥基琥珀酰亞胺耦合(NHS)。