[發明專利]一種檢測生物素酶酶活性的方法

在審

• 申請號: 201711010397.2
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN107817233A
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 郝淑靜;榮恩光;徐朋奇
• 申請（專利權）人: 深圳中科唯新生物技術有限公司;北京中科唯新生物醫學研究所有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測生物素酶酶活性的方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

1)取試劑1、試劑2、試劑3及試劑4，備用；所述試劑1包括緩沖液及酶活穩定劑組成的體系，pH值為4至8，所述試劑2包括底物溶液，所述底物溶液的成分為N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素，濃度為0.05mmol/L至5mmol/L，所述試劑3為終止液，及所述試劑4為標準品；

2)樣本檢測：

2.1)將所述樣本加入所述試劑1，混勻后得樣本混合體系，將所述試劑2加入到所述樣本混合體系中，30℃至39℃溫育，反應結束后向所述樣本混合體系中加入所述試劑3終止反應，混勻后即可檢測；

2.2)檢測條件：激發波長為360±20nm，發射波長為460±20nm，讀取熒光值；

3)空白對照：

3.1)將經煮沸滅活處理后的所述樣本加入所述試劑1，混勻后得空白混合體系，將所述試劑2加入到所述空白混合體系中，30℃至39℃溫育，反應結束后向所述空白混合體系中加入所述試劑3終止反應，混勻后即可檢測；

3.2)檢測條件：激發波長為360±20nm，發射波長為460±20nm，讀取熒光值；

4)使用所述試劑4制備標準曲線；

5)根據所述標準曲線計算出樣本濃度，從而計算出酶的活力。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述緩沖液及酶活穩定劑組成的體系的pH值為5至7.5，所述底物溶液的成分N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素的濃度為0.1mmol/L至3mmol/L；所述樣本檢測步驟中，將所述試劑2加入到所述樣本混合體系中，35℃至39℃溫育；所述空白對照步驟中，將所述試劑2加入到所述空白混合體系中，35℃至39℃溫育。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述緩沖液及酶活穩定劑組成的體系的pH值為5.5至6.5，所述底物溶液的成分N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素的濃度為0.5mmol/L至2mmol/L；所述樣本檢測步驟中，將所述試劑2加入到所述樣本混合體系中，36℃至38℃溫育；所述空白對照步驟中，將所述試劑2加入到所述空白混合體系中，36℃至38℃溫育。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述緩沖液為磷酸緩沖液，pH值為4至8，或所述緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH值為4至6.6，或所述緩沖液為磷酸氫鹽-檸檬酸緩沖液，pH值為4至8，或所述緩沖液為磷酸氫鹽-檸檬酸鹽緩沖液，pH值為4至8，所述緩沖液的濃度為20mmol/L至200mmol/L；所述酶活性穩定劑為乙二胺四乙酸，或乙二胺四乙酸鹽中的一種，或乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽其中之一與牛血清白蛋白兩種合用作為所述酶活性穩定劑，所述乙二胺四乙酸濃度為0.1mmol/L至8mmol/L，所述牛血清白蛋白濃度為0.05mg/ml至1mg/ml；

所述終止液為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH值為9.16至10.83，或所述終止液為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH值為8.6至10.6；

所述標準品為7-氨基-4-甲基香豆素，濃度為10mmol/L。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述緩沖液的濃度為40mmol/L至100mmol/L，所述乙二胺四乙酸濃度為2mmol/L至5mmol/L，所述牛血清白蛋白濃度為0.25mg/ml至0.5mg/ml。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述試劑1包括：pH值為5.2的磷酸鉀緩沖液，濃度為200mmol/L，包括乙二胺四乙酸，濃度為8mmol/L；

所述試劑2包括：N-D-生物素-7-氨基-4-甲基香豆素溶液，濃度為0.1mmol/L；

所述試劑3包括：pH值為9.5的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，濃度為0.5mol/L；

所述試劑4包括：7-氨基-4-甲基香豆素，濃度為10mmol/L。