[發明專利]一種D-手性肌醇的制備方法

有效

• 申請號: 201711009920.X
• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN109706189B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 張以恒;李元;劉珊
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12P7/02
• 分類號: C12P7/02;C12N15/63;C12N15/53;C12N15/61;C12N1/21;C12N1/19
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞

1.一種制備D-手性肌醇的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：

(1)構建共表達耐熱肌肉肌醇脫氫酶和耐熱肌醇單酮異構酶的工程菌、和/或分別表達耐熱肌肉肌醇脫氫酶和耐熱肌醇單酮異構酶的工程菌，其中所述耐熱肌肉肌醇脫氫酶為在50℃以上具有將肌肉肌醇氧化為2-酮基-肌肉肌醇和/或將1-酮基-D-手性肌醇還原為D-手性肌醇功能的酶，所述耐熱肌醇單酮異構酶為在50℃以上具有將2-酮基-肌肉肌醇異構化為1-酮基-D-手性肌醇功能的酶；

(2)將步驟(1)構建的工程菌進行發酵獲得全細胞；

(3)將步驟(2)獲得的全細胞通過熱處理的方式進行細胞膜通透性處理，獲得透性全細胞，其中所述熱處理溫度為55-90℃，熱處理時間為5-30min；

(4)利用步驟(3)獲得的共表達耐熱肌肉肌醇脫氫酶和耐熱肌醇單酮異構酶的透性全細胞，表達耐熱肌肉肌醇脫氫酶的透性全細胞和表達耐熱肌醇單酮異構酶的透性全細胞的混合物，和/或共表達耐熱肌肉肌醇脫氫酶和耐熱肌醇單酮異構酶的透性全細胞、表達耐熱肌肉肌醇脫氫酶的透性全細胞和表達耐熱肌醇單酮異構酶的透性全細胞的混合物催化肌肉肌醇制備D-手性肌醇；

所述耐熱肌肉肌醇脫氫酶來源于嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus kaustophilus)，并且所述耐熱肌醇單酮異構酶來源于嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus kaustophilus)。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱處理溫度為60-80℃。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述熱處理溫度為70℃。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱處理時間為10-25min。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述熱處理時間為20min。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱處理條件為：70℃熱處理20min或65℃熱處理30min。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱處理時的細胞濃度為OD₆₀₀＝20-200。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述熱處理時的細胞濃度為OD₆₀₀＝50-150。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述熱處理時的細胞濃度為OD₆₀₀＝100。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱處理可在無緩沖液體系或緩沖液體系中進行。

11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述熱處理在磷酸鹽緩沖液體系中進行，所述磷酸鹽緩沖液選自磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液。

12.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用透性全細胞或透性全細胞的混合物催化肌肉肌醇制備D-手性肌醇的反應體系中，底物肌肉肌醇的濃度為1-400g/L，透性全細胞或透性全細胞的混合物的加入量為OD₆₀₀＝1-200。

13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，底物肌肉肌醇的濃度為100-350g/L，透性全細胞或透性全細胞的混合物的加入量為OD₆₀₀＝40-100。

14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，底物肌肉肌醇的濃度為300g/L，透性全細胞或透性全細胞的混合物的加入量為OD₆₀₀＝60-80。