[發(fā)明專利]一種豬細(xì)小病毒免疫組合物及其制備方法與應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號(hào): CN107661496A
• 公開（公告）日: 2018-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂紅;陳蕾;余垚;周峻崗
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K39/23
• 分類號(hào): A61K39/23;A61P31/20;A61P1/12;A61P9/00;A61P11/00;A61P17/00;C07K14/015;C12N15/81
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和獸醫(yī)領(lǐng)域，具體涉及一種豬細(xì)小病毒疫苗組合物及其制 備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬細(xì)小病毒(porcin parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙病癥的重要病原之一， 是一種穩(wěn)定且感染持久的病毒，主要引起初產(chǎn)母豬的不孕，流產(chǎn)和產(chǎn)死胎、木乃伊 胎和弱仔等同時(shí)也能引起皮膚病和腹瀉等。1966年英國Mary等在用豬腎原代細(xì) 胞進(jìn)行豬瘟病毒組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)該病毒。1967年Cartwright等從豬流產(chǎn)的胎兒中 分離出豬細(xì)小病毒，并首次驗(yàn)證了它的致病作用，隨后日本、荷蘭等世界各地區(qū)也 先后報(bào)道了該病毒，我國自20世紀(jì)80年代從全國各地也相繼分離到了不同基因型 的PPV。通過近年來世界各個(gè)國家的流行及報(bào)道情況，發(fā)現(xiàn)其通常與其他病原， 如圓環(huán)病毒、繁殖與呼吸綜合征病毒等混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失。目前， 豬細(xì)小病毒血清型單一、具有較高的免疫原性，疫苗接種是控制PPV感染的有效 措施。

PPV是一類較小的負(fù)鏈單股DNA病毒。其基因組大小約為5000個(gè)核苷酸。 成熟病毒粒子為二十面體等軸立體對稱，由32個(gè)殼粒構(gòu)，分子質(zhì)量大約為5.3× 106Da，直徑25nm。完整的、含有核酸的病毒粒子，具有感染性和血凝活性。PPV 與其他細(xì)小病毒的基因組序列具有較高的同源性。PPV基因組中含有兩個(gè)重要的 開放閱讀框架，3’端閱讀框編碼PPV的結(jié)構(gòu)蛋白，5’端閱讀框編碼PPV的非 結(jié)構(gòu)蛋白。

其中PPV基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白共有三種：VP1、VP2和VP3。VP1的相 對分子質(zhì)量為83KD，VP2的相對分子質(zhì)量為64KD，VP3的相對分子質(zhì)量為 60KD。其中VP1和VP2有許多氨基酸序列是重疊的。VP1的N端有一個(gè)脯氨酸 豐富區(qū)，對病毒轉(zhuǎn)移其重要作用，是PPV復(fù)制和包裝過程中不可缺少的一種結(jié)構(gòu) 蛋白，參與PPV與細(xì)胞特異性結(jié)合，有利于病毒侵染細(xì)胞。VP3是VP2的水解 產(chǎn)物，在VP2蛋白N端有9個(gè)連續(xù)甘氨酸，這種甘氨酸富集區(qū)折疊形成的α螺旋 結(jié)構(gòu)可能就是VP3的切割位點(diǎn)。

VP2蛋白是PPV衣殼蛋白的主要成分，在VP2蛋白上有PPV最主要的抗 原決定簇，因此VP2蛋白是PPV主要的免疫保護(hù)性抗原，而且VP2蛋白還能在 體外自我裝配成類病毒顆粒(VLPs)。VP2蛋白的N端是位于PPV的內(nèi)部，將 外源基因片段連于N末端，不會(huì)破壞PPV病毒粒子的空間結(jié)構(gòu)，因此可以將VP2 蛋白N端與外源基因相連，以此來表達(dá)外源基因。VP2蛋白的C端是展示在其表 面的，這樣便于其保持其二級(jí)結(jié)構(gòu)。VP2不僅是衣殼蛋白的重要組成部分，而且在 PPV的進(jìn)化、傳播的過程中扮演著非常重要的角色。VP2具有血凝性，并且與該 病毒的宿主范圍和抗原性密切相關(guān)。NS1、NS2和NS3是PPV基因組編碼的三種 非結(jié)構(gòu)蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白的作用主要是輔助病毒DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄及病毒的 組裝過程。

PPV的感染尚無有效的治療方法，疫苗免疫預(yù)防仍是控制該病的主要手段。 目前PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活 病毒載體疫苗等。其中滅活疫苗具有安全性好、產(chǎn)生抗體時(shí)間長、不需要低溫保存 的優(yōu)點(diǎn)，但是滅活疫苗產(chǎn)生抗體慢，不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，抗體水平相對活疫苗 較低，需重復(fù)接種，使用劑量大；弱毒疫苗免疫效力較強(qiáng)、產(chǎn)生抗體快、用量少、 成本低，但安全性較差；基因工程亞單位疫苗免疫源性較好，但成本和技術(shù)要求都 比較高；基因工程活病毒載體疫苗可以同時(shí)預(yù)防兩種病或多種病的、能夠誘導(dǎo)較強(qiáng) 的免疫反應(yīng)，但生產(chǎn)技術(shù)復(fù)雜、成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種免疫效果好、生產(chǎn)成本低、工 藝簡單以及更安全的新型豬細(xì)小病毒疫苗，并提供了其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明在第一方面提供了一種豬細(xì)小病毒疫苗組合物，包含以下a)和b)、 基本上由以下a)和b)組成、或者由以下a)和b)組成：

a)、由馬克斯克魯維酵母重組工程菌表達(dá)的豬細(xì)小病毒VP2蛋白自組裝形 成的類病毒顆粒；

b)、藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的用于注射制劑的輔料；

其中，上述馬克斯克魯維酵母重組工程菌是由編碼上述豬細(xì)小病毒VP2蛋 白的基因序列插入馬克斯克魯維酵母表達(dá)載體所構(gòu)成的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化馬 克斯克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建得到；上述重組表達(dá)載體編碼上述豬細(xì)小 病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。