[發明專利]一種雙基因穩定表達的組織工程骨

在審

• 申請號: 201711003109.0
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN109692346A
• 公開（公告）日: 2019-04-30
• 發明（設計）人: 關茜茹
• 申請（專利權）人: 關茜茹
• 主分類號: A61L27/24
• 分類號: A61L27/24;A61L27/20;A61L27/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種組織工程化骨，具體地說關于一種雙基因穩定表達的組織工程化骨及其制備方法。本發明的技術方案如下：一種Nell?1與VEGF穩定表達的脂肪來源間充質干細胞構建組織工程化骨，它由下列方法制得：(1)質粒介導的Nell?1與VEGF基因協同轉染體外培養的脂肪來源間充質干細胞，并對細胞傳代檢測其表達情況；(2)將步驟(1)得到的細胞系與載有鹽酸軟骨素的膠原基骨修復材料共同培養，即獲得能夠穩定表達Nell?1與VEGF基因的組織工程骨。本發明優點表現在：Nell?1與VEGF基因協同修飾的添加鹽酸軟骨素的膠原基組織工程化骨，新骨形成效果優于BMP2、Nell?1或VEGF單獨修飾的普通組織工程骨。

技術領域

本發明涉及一種組織工程骨，具體地說關于一種雙基因穩定表達的組織工程骨及其制備方法。

背景技術

Nel樣分子I型(Nel-like type I molecular，NELL-1)是一種與人顱縫早閉癥相關的外分泌型蛋白，近年來一系列體外及體內研究表明NELL-1更是一種非常有效的骨生長因子。與其他骨生長因子相比，NELL-1的生物學效應相對單一，其骨誘導活性也更具有特異性，同時它無法單獨誘導異位骨組織形成，因此NELL-1可具有更高的生物安全性和精準性。NELL-1作為一種全新的生長因子在治療各類骨組織缺損與骨再生方面具有廣闊而良好的應用前景。研究證實NELL-1不僅能通過骨膜化骨還能通過軟骨化骨的方式誘導骨再生。

VEGF在骨愈合過程中具有重要作用，它能與血管內皮細胞表面的特異性受體結合，一方面可以促進內皮細胞增殖、遷移；另一方面增加局部毛細血管通透性，使纖維蛋白原滲出，于周邊形成凝膠樣基質，可支持并誘導毛細血管長入。VEGF作為促使內皮細胞增殖、趨化的特異性細胞素，對于軟骨內成骨及骨折愈合過程中的血管增生發揮著重要作用。VEGF作為旁分泌因子參與骨的形成與代謝，還可通過作用于成骨細胞強表達的VEGFR-1受體增加成骨細胞移動和分化功能，參與骨折的修復、塑型和改造過程，對骨形成及修復起到正性調節作用。Spector發現VEGF能引發成骨細胞的遷移及分化，且引起成骨細胞遷移及分化所需的濃度比BMP-2還低100倍。在軟骨內化骨，特別是在骨形成偶合軟骨吸收的過程中，VEGF對原始成骨細胞有趨化遷移作用，對骨的形成和重建有功能性的作用。

ADSCs通過抽脂的方式獲得，不僅具有很強的體外擴增能力和多向分化潛能，且來源充足、易于分離培養，多次傳代后細胞的增殖速度無明顯減慢。ADSCs具有多向分化潛能，可向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞乃至其他胚層方向分化。該細胞還具有促進創面愈合和組織修復、促進血管新生以及免疫調節等功能。實驗證明，相同條件下ADSCs比BMSCs產生更多的骨原細胞和細胞外鈣化的基質成分。ADSCs促血管新能力和BMSCs沒有差別，它具有分化血管內皮細胞的潛能并參與進行血管構成。在低氧環境中ADSCs上清能明顯促進血管內皮細胞的生長和減少內皮細胞凋亡。干細胞向血管內皮細胞分化的誘導實驗發現，ADSCs比BMSCs能夠形成更多完整的管狀結構。ADSCs還能夠抑制對供體細胞的免疫應答作用。

骨基質主要由有機質和無機質組成。有機質中包括膠原纖維和無定形基質，其中膠原纖維約占有機質的95％骨組織中絕大多數細胞都粘附在膠原表面生長，同時膠原也維持著骨組織的韌性，掃描電鏡下可見骨基質中的膠原纖維分支連結成網狀無定形基質為中性和酸性黏多糖，其中以嗜堿性的4-鹽酸軟骨素和6-鹽酸軟骨素為主，它們可促進細胞粘附，提高骨組織的強度和韌性骨的無機鹽是由磷酸鈣形成的亞微沉淀物構成，與無機鹽HAP[Ca10(PO4)6(OH)2]非常相近。在骨組織中，骨膠原纖維的抗壓性和彈性較差，而HAP結晶則脆性較大，易碎裂，當兩者以特定的結構結合在一起時，骨組織即擁有獨特的強度和韌性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種Nell-1與VEGF協同修飾脂肪來源干細胞構建組織工程化骨及其制備方法。