[發(fā)明專利]一種用于河川沙塘鱧精子保存的抗凍液及其使用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710999270.1
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN107624754A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程順;顧志敏;賈永義;遲美麗;劉士力;蔣文枰;王雨辰
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省淡水水產(chǎn)研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 杭州千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司33246
• 代理人: 趙衛(wèi)康

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及魚類精子保存方法，具體涉及一種河川沙塘鱧精子的超低溫冷凍保存方法。

背景技術(shù)

河川沙塘鱧屬于鱸形目、蝦虎魚亞目、塘鱧科、沙塘鱧屬。常見于我國長江中下游及其附屬水域，具有較高的經(jīng)濟價值。近年來魚類精子超低溫冷凍技術(shù)逐漸擴展到鯉科、鯰科和鱒魚類，為魚類的人工繁殖做出了很大的貢獻，對那些稀有或者瀕臨滅絕的魚類物種的保護起到積極的作用。魚類精子超低溫冷凍技術(shù)主要分為三種：小丸顆粒冷凍法、安瓿瓶冷凍法和麥細管冷凍法。這三種方法均需要程序控溫，對降溫過程的控制相當準確。對于野外操作，或者處于衰減狀態(tài)的精子將不能使用。

在中國專利CN101084927A中公開了一種中華鱘精子超低溫冷凍保存技術(shù)及工藝，其主要步驟包括鮮精采集、精子稀釋、平衡、加抗凍劑、分裝、程序降溫等步驟。冷卻過程需要大型自動化儀器的支持，不方便野外工作和批量生產(chǎn)。

目前有研究對中華烏塘鱧精子進行了超低溫冷凍，這是首次對塘鱧科魚類精子的超低溫冷凍研究。但是這種冷凍方法對于河川沙塘鱧的冷凍效果并不理想，冷凍液的作用不佳，解凍后的精子活力不強，存活時間短，甚至凋亡。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷提出了一種用于河川沙塘鱧精子保存的抗凍液，將稀釋液和抗凍劑混合后再與精子混合，最大限度的較少了由于實驗操作對鏡子產(chǎn)生的傷害。冷凍液中適宜的鹽度和氯化鉀濃度可以使河川沙塘鱧精子的活動受到抑制，能夠保留精子細胞的自身能量且激活后活力未見顯著下降。同時抗凍液使精子細胞少量失水，防止河川沙塘鱧精子在冷凍過程因低溫和脫水而失去活性，保證了精子冷凍儲存過程中的成活率。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種用于河川沙塘鱧精子保存的抗凍液，包含體積比為包含體積比為1：5-15的抗凍劑、稀釋液。例如，抗凍劑、稀釋液的體積比為1:5、1：5.5、1：7.5……，優(yōu)選的，抗凍劑與稀釋液的體積比為1:5，進一步優(yōu)選的，抗凍劑與稀釋液的體積比為1:10。

在一個實施方案中，所述稀釋液，包含0.34~0.36克NaCl和3.4~3.6克的蔗糖，以水為100 毫升計；

在另一個實施方案中，稀釋液包含0.76~0.79克NaCl、0.020~0.022克CaCl2、0.015~0.023克KCl和0.18~0.21克NaHCO3，以水為100 毫升計；

在再一個實施方案中，稀釋液包含0.7~0.85克NaCl、0.04 ~0.06克KCl和1.3~1.6克葡萄糖，以水為100 毫升計；

在又一個實施方案中，稀釋液包含0.795~0.803克NaCl、0.037~0.042克KCl、0.013~0.015克CaCl2、0.034~0.036克NaHCO3、0.0004~0.008克KH2PO4和0.032~0.036克葡萄糖，以水為100毫升計；

在又一個實施方案中，包含0.79~0.81克NaCl、0.039~0.041克KCl、0.019~0.020克MgSO4?7H2O、0.0070~0.0074克Na2HPO4?12H2O、0.0053~0.0053克KH2PO4、0.034~0.035克NaHCO3和0.095~0.10克葡萄糖，以水為100毫升計。

為了維持稀釋液的穩(wěn)定性，稀釋液配置完成后保存于4℃下（例如可以使用冰箱）中待用。

所述抗凍劑為甲醇、乙二醇、二甲基亞砜和甘油中的一種或至少兩種。優(yōu)選為甲醇，例如甲醇與所述稀釋液的體積比為1：7.33

一種河川沙塘鱧精子的保存方法，將河川沙塘鱧精子以上述的抗凍液作為冷凍介質(zhì)進行冷凍保存。冷凍保存之前還包括將河川沙塘鱧精子與抗凍液混合后得到的混合液在4℃下靜置5-10min。

河川沙塘鱧精子與抗凍液按1：3-6體積比例混合，優(yōu)選為1：5。

在冷凍保存之前，對河川沙塘鱧精子的提取的形式不作限定。較好地，可提供一種提取的方法，具體為：取自提前14h注射激素的雄魚。采精前14 h對雄魚注射絨毛膜促性腺激素（HCG）和促黃體釋放激素（LRH-A2），以促進精子成熟。采集精子時剖開魚腹腔，取出精巢后快速在干凈的培養(yǎng)皿中剪碎，避免接觸到水。