[發明專利]一種用于微滴式核酸絕對定量標定的試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710999114.5
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN107619858A
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 陳晨;王晶;趙興春;崔生輝;李亮;黃杰;原霖;王巖;鄭淑蕓
• 申請（專利權）人: 北京佰鷗創投生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙)11498
• 代理人: 王加嶺,楊靜

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種用于微滴式核酸絕對定量標定的試劑盒及應用。

背景技術

標準物質(reference material,RM)是具有一種或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準設備、評價測量方法或給材料賦值的材料或物質。核酸標準物質是指用于核酸擴增技術的標準物質，屬于生物標準物質的一種。由于核酸不能單獨應用物理和/或化學的方法進行準確描述，因此必須應用生物學反應來補充描述其特性，所以迄今為止傳統意義的一級參考測量程序(物理和化學方法)和一級參考物質在核酸擴增技術檢測中還沒有。

在核酸標準品領域，英國國家生物制品檢定所作為WHO指定的國際標準品實驗室，是目前全世界最主要的國際標準品和參考品生產者和分發者，生產超過95％的國際標準品。WHO于1997年發布了首個用于核酸擴增技術的核酸標準物質———丙型肝炎核酸(RNA)國際標準物質，隨后陸續發布了乙型肝炎核酸、人類免疫缺陷病毒－1型核酸等16種不同病毒核酸的標準物質。WHO發布的一系列核酸標準物質是目前最為廣泛應用于分子檢測方法校正和定量的標準物質。WHO制備的核酸標準物質的定值采用通過國際多家權威實驗室合作來進行定值，使當前不同實驗室、不同檢測方法得出的檢測結果的表述單位統一使用國際單位(IU)表示。

目前，中國在核酸標準物質的研制方面才剛剛起步。2005年，中國衛生部臨床檢驗中心研制的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸血清標準品、丙型肝炎病毒核糖核酸血清標準品被國家質檢總局批準為國家二級標準品。這是中國在核酸檢測領域首次引入國際標準，對中國肝炎病毒核酸定量檢測系統的標準化及檢驗結果的準確性和可比性起到了極大的推動作用。中國獸醫藥品監察所作為中國獸用標準物質研制、供應的唯一法定單位，目前尚無核酸標準物質提供。

在核酸標準物質的定量上，由于技術條件的限制目前的國際單位通常只代表PCR的最低檢測限單位或等量基因組，無法精確定量到目的基因拷貝數。隨著近年來數字PCR技術的發展，使得絕對定量成為可能，數字PCR技術將會越來越多的應用于核酸標準物質的研究和定量。

數字化PCR(Digital PCR，dPCR)的概念早在1999年就由Bert Vogelstein采用并發表相關文獻，其初衷是為了能夠從臨床樣品(如尿液、淋巴液、血漿、糞便等)大量的正常體細胞中檢測出微量的突變細胞，但由于當時能用于稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此還不能非常好地體現數字PCR的核心理念——“無限稀釋”(terminal dilution)。Bio-Rad公司的QX200系統核心的微滴化技術能夠將一份樣品分成20,000個納升級的微滴，本質上將傳統定量PCR的一個test變成20,000個test，大大提高了核酸序列檢測的靈敏度和精準度，是對“無限稀釋”這一概念的完美演繹，其方法原理可稱為微滴式數字化PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)。QX200 ddPCR系統包括兩臺儀器：微滴發生器和微滴分析儀，及其相關的耗材。微滴發生器將每個樣品分成20,000個均勻的納升級微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。每個微滴都作為一個獨立的PCR反應器。隨后微滴轉移至96孔PCR板上，開展終點PCR擴增。采用微滴分析儀(droplet reader)逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，最終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數。與傳統的定量PCR相比，數字PCR的精確度和靈敏度更佳。利用微滴式數字PCR技術，研究人員可以檢測稀有突變，精確測定拷貝數變異，并對基因表達進行絕對定量。

核酸標定通用版試劑盒中內標基因的尋找：由于內標的組成一般是一段150bp的寡核苷酸的序列。用于監控提取的效率，矯正檢測數據。用于內標的序列必須是和所有物種的序列都不匹配，不會干擾正常的實驗，所以其尋找的工作量巨大，而且不一定能獲得。在150bp長度的序列上設計引物探針用于絕對定量的檢測也是很難攻克的問題。

目前絕對定量的檢測試劑是封閉的，試劑的檢測效率不是最佳的，例如有2000copies濃度的原樣，只能檢測出1500copies，需要優化試劑提高檢出率。絕對定量的關鍵技術微分化技術由于試劑原因也受限，由于絕對定量最后是用泊松分布統計學建模得出絕對定量的數據，泊松分布統計學建模是通過總微分化的數量和陽性微單位的數量得出相應的系數，從而給出絕對定量的數值，所以最后微分化的量是影響結果的關鍵。