[發明專利]一種測定金霉素效價的方法

在審

• 申請號: 201710993944.7
• 申請日: 2017-10-23
• 公開（公告）號: CN107779492A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 謝昌賢;云喜報;于俊蘭;高美霞;秦定宇;劉運添;王鵬飛
• 申請（專利權）人: 金河生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12R1/085
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

1.一種測定金霉素效價的方法，以蠟樣芽孢桿菌為試驗菌種，采用管碟法進行金霉素效價的測定，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)配制鹽酸金霉素工作標準溶液

精密稱定適量鹽酸金霉素，分別配制濃度為0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.04μg/mL、0.08μg/mL、0.16μg/mL的鹽酸金霉素工作標準溶液；

(2)繪制標準曲線，獲得載距a、斜率b和相關系數r的取值

以濃度為0.04μg/mL的鹽酸金霉素工作標準溶液分別作為濃度為0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.08μg/mL和0.16μg/mL的鹽酸金霉素工作標準溶液的參比溶液，采用管碟法進行試驗，通過抑菌圈自動測量分析軟件繪制標準曲線，獲得所述標準曲線的載距a、斜率b和相關系數r的取值及參比溶液產生的抑菌圈直徑或面積的總平均值Y_0p總；

所述管碟法具體為：針對除參比溶液外的其它四種濃度的鹽酸金霉素工作標準溶液，以所述每種鹽酸金霉素工作標準溶液進行管碟法試驗時，至少設置三個鋪有蠟樣芽孢桿菌菌層培養基的培養皿，每個培養皿中間隔放置六枚鋼管，交叉滴定參比溶液和該鹽酸金霉素工作標準溶液，然后在30℃下培養16-18小時后，放入抑菌圈自動測量分析儀中進行測試；

(3)金霉素樣品效價測定

精密稱定適量金霉素樣品，根據所述金霉素樣品的估計效價配制金霉素濃度為0.04μg/mL的樣品溶液，然后至少設置三個鋪有蠟樣芽孢桿菌菌層培養基的培養皿，每個培養皿中間隔放置六枚鋼管，交叉滴定步驟(2)中的參比溶液和所述樣品溶液，然后在30℃下培養16-18小時后，放入抑菌圈自動測量分析儀中進行測試，通過抑菌圈自動測量分析軟件，獲得參比溶液產生的抑菌圈直徑或面積的平均值Y_0p及樣品溶液產生的抑菌圈直徑或面積的平均值Y_kp，通過以下公式計算金霉素樣品效價：

金霉素樣品效價＝C×稀釋因子×10^-6×100％；

式中：C為試驗過程中樣品溶液中金霉素的實際濃度，計算公式為Y_kjz為校正直徑或面積，計算公式為Y_kjz＝Y_0p總-Y_0p+Y_kp；稀釋因子的計算公式為：稀釋因子＝2.5×10⁷At，At為金霉素樣品的估計效價。

2.根據權利要求1所述的一種測定金霉素效價的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述鹽酸金霉素工作標準溶液的具體配制方法為：精密稱定適量鹽酸金霉素，溶于濃度為0.01mol/L的HCl溶液中，配制鹽酸金霉素標準儲備液；以所述鹽酸金霉素標準儲備液為母液，pH為4.5的濃度為0.1M的磷酸鹽緩沖液為稀釋劑，分別配制濃度為0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.04μg/mL、0.08μg/mL、0.16μg/mL的鹽酸金霉素工作標準溶液。

3.根據權利要求1所述的一種測定金霉素效價的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述樣品溶液的具體配制方法為：先將金霉素樣品充分研磨，過100目篩，然后精密稱定適量金霉素樣品，加入萃取液中，密封，磁力攪拌或超聲30分鐘后調pH為≤1.2，經過濾后，以pH為4.5的濃度為0.1M的磷酸鹽緩沖液為稀釋劑，配制出金霉素濃度為0.04μg/mL的樣品溶液。

4.根據權利要求3所述的一種測定金霉素效價的方法，其特征在于，所述萃取液為濃度為4mol/L的HCl、丙酮和純化水按體積比1:13:6混合后形成的混合液。

5.根據權利要求1-4任一項所述的一種測定金霉素效價的方法，其特征在于，所述管碟法中使用的培養皿規格為：Φ90×16-17mm；鋼管規格為：內徑為6.0±0.1mm，高為10.0±0.1mm。