[發明專利]一種枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽及其應用

在審

• 申請號: 201710990059.3
• 申請日: 2017-10-23
• 公開（公告）號: CN107698668A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 潘力;劉欣;葉燕銳;王斌
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C07K14/32
• 分類號: C07K14/32;C12N15/31;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 劉瑜,蘇運貞

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別涉及一種枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽及其應用。

背景技術

原核表達系統是現代生物技術的重要研究內容，其具有生長快，易培養，表達量高，遺傳背景清楚以及分子操作簡單的特點，且適合進行工程菌株改造等顯著優勢，已廣泛地應用于異源蛋白質的表達。枯草芽胞桿菌(Bacillus subttlis)是原核生物研究領域中僅次于大腸桿菌(Escherichia coli)的重要模式菌，是目前原核表達系統中分泌表達外源蛋白較理想的宿主。該宿主的優點是：公認的安全菌株，分泌表達，無明顯的密碼偏愛性。

基因工程中，信號肽對外源基因的表達水平有極大影響，是實現外源蛋白分泌表達的重要組成元件。信號肽是一類具有15-60個氨基酸的多肽，一般定位于分泌蛋白的N端。一般是將編碼目的蛋白的基因序列克隆至信號肽的C端，從而在宿主菌中實現目的基因和信號肽序列在轉錄和翻譯水平的融合。信號肽引導整個多肽鏈與胞內分子伴侶或者分泌信號識別位點相結合，進而跨膜轉運至胞外。因此，研究不同種類的信號肽對于實現外源基因的高效表達及分泌機制等均有重要意義。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽。

本發明的另一目的在于提供所述枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽的編碼基因。

本發明的又一目的在于提供所述枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

編碼所述枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽的基因，其核苷酸序列選自如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或者其互補序列；

(b)對SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列進行一個或多個核苷酸取代、缺失或添加所獲得的，具有與SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相同的作為信號肽功能的核苷酸序列或者其互補序列。

含上述任一所述枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽的基因的重組表達載體、重組基因工程菌、轉基因細胞系或表達盒也屬于本發明的保護范圍。

所述的重組基因工程菌為將上述任一所述枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽的基因融合到需要表達基因的N端，使融合后的基因編碼的蛋白的N端融合有相應信號肽；優選為分泌β-半乳糖苷酶能力提高的基因工程菌，或為能分泌轉谷氨酰胺酶的基因工程菌；更優選為枯草芽孢桿菌基因工程菌。

所述的枯草芽孢桿菌可提高分泌效率的信號肽在提高蛋白分泌表達中的應用。

所述的蛋白為耐熱β-半乳糖苷酶或轉谷氨酰胺酶。

所述的蛋白分泌表達為在原核表達系統中分泌表達。

所述的原核表達系統優選為枯草芽孢桿菌；更優選為枯草芽孢桿菌ATCC6051(B.subtilis ATCC6051)。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

1、本發明通過從枯草芽孢桿菌同源蛋白信號肽庫中，構建各種信號肽與β-半乳糖苷酶編碼基因相結合的表達載體，結合高通量的篩選方法，篩選出能提高β-半乳糖苷酶分泌的信號肽。同時構建該信號肽與轉谷氨酰胺酶酶原編碼基因相結合的表達載體，實現了轉谷氨酰胺酶酶原的分泌表達。

2、本發明提供了一種氨基酸片段，具有很強的分泌表達活性的信號肽，能實現外源基因的高表達，特別是為枯草芽孢桿菌表達外源基因提供了有效的元件。

3、本發明通過融合信號肽，可以使β-半乳糖苷酶分泌量增加，酶活得到進一步提高。

4、本發明通過融合信號肽，實現轉谷氨酰胺酶酶原分泌表達。

附圖說明

圖1是實施例1中擴增biobrick的PCR產物電泳圖；其中，泳道M為marker DNA，泳道1為biobrick的PCR擴增產物。

圖2是實施例1中質粒pBEp43s-biobrick-bgaB和質粒pBEp43-SP-bgaB構建示意圖。

圖3是實施例2中擴增SPywgB片段電泳圖；其中，泳道M：marker DNA；泳道1為SPywgB片段。

圖4是實施例2中表達質粒pBEp43-SPywgB–proMTG的構建示意圖。