[發(fā)明專利]一種甘露聚糖酶的工業(yè)發(fā)酵方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710989548.7
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN108396017A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發(fā)明（設計）人: 付振山;趙士輝;黃興義;王淑華
• 申請（專利權）人: 山東奧博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12R1/84
• 代理公司: 濟南日新專利代理事務所 37224
• 代理人: 劉亞寧

1.一種甘露聚糖酶的工業(yè)發(fā)酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟1：一級發(fā)酵罐發(fā)酵

在一級發(fā)酵罐中裝入一級發(fā)酵培養(yǎng)基和聚醚改性硅消泡劑，發(fā)酵培養(yǎng)基和聚醚改性硅消泡劑的體積比為6000-8500：1；對發(fā)酵培養(yǎng)基加熱，使發(fā)酵培養(yǎng)基溫度上升至121-123℃，保持罐壓1.1-1.4MPa，滅菌25-40min；滅菌結束后，對一級發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基進行冷卻，當溫度降至29-32℃時，將畢赤酵母發(fā)酵種子液以體積比為5-10％的接種量移種到一級發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)，向發(fā)酵罐中補加微量元素溶液，微量元素溶液和發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1：20-25；發(fā)酵種子液接種量為1.5-2％；一級發(fā)酵罐轉速為180-200rpm；培養(yǎng)溫度為29-32℃；當一級發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的殘?zhí)堑陀?-3.5g/L或者濕重≥55-60g/L時，停止；通風量，0-6h為45-50m³/h，6h-結束為65-70m³/h；一級發(fā)酵罐罐壓控制在0.03-0.08Mpa；

步驟2：二級發(fā)酵罐發(fā)酵

在二級發(fā)酵罐中裝入二級發(fā)酵培養(yǎng)基和聚醚改性硅消泡劑，發(fā)酵培養(yǎng)基和聚醚改性硅消泡劑的體積比為6000-8500：1；對發(fā)酵培養(yǎng)基加熱，使發(fā)酵培養(yǎng)基溫度上升至121-123℃，保持罐壓1.1-1.4MPa，滅菌25-40min；滅菌結束后，對二級發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基進行冷卻，當溫度降至29-32℃時，將一級發(fā)酵罐培養(yǎng)的菌體以體積比為10-15％的接種量移種到二級發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)，二級發(fā)酵罐培養(yǎng)為恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為29-32℃，二級發(fā)酵罐轉速為180-200rpm，當二級發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的濕重≥80g/L時停止；通風量，0-6h為550-650m³/h，6h-結束為850-950m³/h；所述二級發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中發(fā)酵液的pH為4.5-4.6；二級發(fā)酵罐罐壓控制在0.03-0.08Mpa；

步驟3：高密度發(fā)酵

在高密度發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基和聚醚改性硅消泡劑，發(fā)酵培養(yǎng)基和聚醚改性硅消泡劑的體積比為6000-8500：1；對發(fā)酵培養(yǎng)基加熱，使發(fā)酵培養(yǎng)基溫度上升至121-123℃，保持罐壓1.1-1.4MPa，滅菌25-40min；滅菌結束后，對高密度發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基進行冷卻，當溫度降至29-32℃時，將二級發(fā)酵罐培養(yǎng)的菌體以體積比為10-13％的接種量移種到高密度發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)，高密度發(fā)酵罐培養(yǎng)為恒溫培養(yǎng)，高密度發(fā)酵罐轉速為120-140rpm；從發(fā)酵起始24小時內用氨水控制發(fā)酵液的pH值在4.5-4.7，直至溶解快速反彈至80％時停止；培養(yǎng)溫度控制在29-32℃；通風量：0h-4h，1500-1600m³/h；大于4h：2200-2400m³/h；高密度發(fā)酵罐壓控制在0.03-0.08Mpa；

步驟4：補料發(fā)酵

向高密度發(fā)酵罐中補加料液；

在0-2h小時內，以300-350L/h的速度流加料液；

在2-4h小時內，以500-550L/h的速度流加糖液；在4小時以后，以650-700L/h的速度流加料液；補料發(fā)酵整個過程中，當DO低于25％時，降低各時段內料液流速20％；DO低于20％時，則停止料液流加，直至溶氧回升；當發(fā)酵液的菌體濕重達到190g/L時，停止流加；

每噸料液中含有葡萄糖55-70kg、30％濃度的甘油15-20kg，NH₄H₂PO₄ 5-7kg、K₂SO₄ 10-15kg、MgSO₄ 4-9kg、CaSO₄ 0.8-1.5kg、KOH 0.3-0.6kg，其余為水；

步驟5：饑餓

停止補料后，不補加任何碳源，觀察DO回升至80％，pH值回升0.2-0.3時停止；

步驟6：誘導、混飼

0-1h按40L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1體積比的混合液；1-2h按45L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1體積比的混合液；2-3h按50L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1體積比的混合液；3-5h按65L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按7:1體積比的混合液；5-7h按80L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按6:1體積比的混合液；7-9h按95L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按5:1體積比的混合液；9-11h按110L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按4:1體積比的混合液；11-13h按120L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按3:1體積比的混合液；13-19h按130L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按2:1體積比的混合液；19-22h按140L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加質量百分濃度50％的葡萄糖溶液和甲醇按1:1體積比的混合液；

22h后，按145L/h的流速向高密度發(fā)酵罐中流加鹽溶液和甲醇按1:4體積比的混合液并根據發(fā)酵液的噸位和溶氧量調節(jié)轉速、空氣流量以及混合液流速，具體為：控制溶氧在20％以上，當溶氧升至60％時，將混合液流速加大20％，如不能保持溶氧在20％以上，則停止混合液流加，直至溶氧回升；

其中鹽溶液的配方為：

CuSO₄·5H₂O 3-3.8g、NaI0.03-0.08g、MnSO₄·H₂O1.5-2g、H₃BO₃ 0.01-0.03g、Na₂MoO₄.2H₂O 0.1-0.3g、CoCl₂0.2-0.5g、ZnCl₂ 10-16g、FeSO₄·7H₂O30-45g、H₂SO₄ 2.5-3g、生物素0.2-0.3g；當直至發(fā)酵液中濕菌重達到180g/L時，流加甘油進行混飼，混飼流速為40-60L/h；誘導開始后90-110h停止混飼；甘油的濃度為10-15％；

誘導不低于160-170h后，結束發(fā)酵。